中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法 实时荧光 PCR法 Detection method of Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water — Real‑time PCR methodICS 07.100.20 CCS X 04 2025 ‑12‑11发布 2026 ‑07‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5876—2025SN/T 5876—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：拱北海关技术中心 、珠海粤港食品安全检测有限公司 、太原海关技术中心 。 本文件主要起草人 ：冯家望、黎财慧、张敏爱、游淑珠、唐食明、姚丽锋、王小玉、张晴阳、陈敬、曾俊洁。 ⅠSN/T 5876—2025 包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件描述了包装饮用水中铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa ）实时荧光 PCR检测方法 。 本文件适用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的实时荧光 PCR法检测，其他类型水质参照本文件 使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件 ，仅 该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 8538　食品安全国家标准 　饮用天然矿泉水检验方法 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 27403 —2008　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 实时荧光 PCR　real time PCR 在PCR扩增时加入带有荧光基团的特异性探针 （Taqman探针）或荧光染料 ，使PCR产物的积累与 荧光信号的积累完全同步 ，实现 PCR产物的实时监测 。 3.2 Ct值 Cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 （cetyltrithylammonium bromide ） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） dATP：脱氧腺苷三磷酸 （deoxyadenosine triphosphate ） dCTP：脱氧胞苷三磷酸 （deoxycytidine triphosphate ） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸 （deoxyguanosine triphosphate ） dTTP：脱氧胸苷三磷酸 （deoxythymidine triphosphate ） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate ） FAM：6‑羧基荧光素 （6‑carboxy fluorescein ） 1SN/T 5876—2025 gryB：细菌中编码促旋酶 B亚单位的基因 （the gene encoding the subunit B of gyrase ） MGBNFQ ：小沟结合物无荧光淬灭基团 （minor groove binder/non ‑fluorescent quencher ） PCR：聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷 [tris（hydroxy methyl ）aminomethane ] 5 方法提要 按照 GB 8538进行水样过滤和培养后 ，分别计数可疑菌落 ，并取可疑菌落提取其 DNA，以铜绿假单 胞菌特异性 gyrB基因片段为扩增靶标进行实时荧光 PCR检测，根据 Ct值实现对可疑菌落的快速筛 选，按照 GB 8538进行生化鉴定后 ，根据公式计算后报告每 250 mL水样中的铜绿假单胞菌数 。 6 主要设备及耗材 6.1 天平：感量 0.1 g。 6.2 过滤设备 。 6.3 恒温培养箱 ：36 ℃± 1 ℃。 6.4 紫外灯：波长应为 360 nm± 20 nm。 6.5 高速冷冻离心机 ：离心力 ≥12 000 g。 6.6 涡旋振荡仪 。 6.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。 6.8 Ⅱ级生物安全柜 。 6.9 实时荧光 PCR仪。 6.10 不同量程移液器 ：100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL。 6.11 离心管：2 mL、1.5 mL和0.2 mL。 6.12 PCR管。 6.13 无菌亲水性微孔滤膜 ：直径 47 mm，孔径 0.45 μm。 7 培养基与试剂 除另有规定外 ，试剂为分析纯或生化试剂 。试验用水应符合 GB/T 6682中一级水的规格 。所有试 剂均用无 DNA酶污染的容器分装 。 7.1 CN琼脂：成分和配制方法见 GB 8538。 7.2 营养琼脂 ：成分和配制方法见 GB 8538。 7.3 无菌生理盐水 ：成分和配制方法见 GB 8538。 7.4 无菌磷酸盐缓冲液 ：成分和配制方法见 GB 8538。 7.5 DNA提取液：称取 0.1 g chelex 100粉末，加入 100 mL灭菌蒸馏水中 ，摇匀即可 。也可使用等效的 商业化 DNA提取试剂盒 。 7.6 HS Taq DNA聚合酶。 7.7 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 7.8 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris‑HCl （pH 8.4） ，200 mmol/L KCl ，15 mmol/L MgCl 2。 7.9 阳性质控菌株 ：铜绿假单胞菌标准菌株 [CMCC（B） 10282或等效标准菌株 ]。 7.10 阴性质控菌株 ：恶臭假单胞菌标准菌株 [CMCC（B） 10283或等效标准菌株 ]。 7.11 试验用引物探针见表 1，扩增片段序列参见附录 A（GenBank ：NC_ 002516 .2） 。 2SN/T 5876—2025 表1　引物探针序列 名称 gyrB‑F gyrB‑R gyrB‑P引物探针序列 （5’→3’） GGCGTGGGTGTGGAAGTC TGGTGAAGCAGAGCAGGTTCT FAM‑TGCAGTGGAACGACA‑MGBNFQ目的基因 gyrB 上述实时荧光 PCR扩增的引物和探针加超纯水配制成 100 μmol/L储备液，工作液需用储备液稀释 至10 μmol/L。 8 检验程序 包装饮用水中铜绿假单胞菌的检验程序见图 1。 ! 
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图1　包装饮用水中铜绿假单胞菌的检验程序 9 检测步骤 9.1 水样过滤和培养 按GB 8538用过滤设备将 250 mL水样或稀释后的水样 （用无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液稀 释）通过孔径 0.45 μm的无菌滤膜过滤 。将过滤后的滤膜贴在 CN琼脂平板上 ，滤膜截留细菌面向上 ，平 铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡 。将平板倒置 ，36 ℃± 1 ℃培养 24 h~48 h，并防止干燥 。 3SN/T 5876—2025 9.2 结果观察与计数 在培养 20 h~24 h和40 h~48 h后观察滤膜上菌落的生长情况并计数可疑菌落 。若培养 40 h~ 48 h导致菌落过分生长而出现菌落融合 ，造成无法计数时 ，参考培养 20 h~24 h时的菌落计数结果 。 铜绿假单胞菌典型菌落在 CN琼脂上具有以下特征之一 ： a） 蓝色或绿色菌落 ； b） 紫外灯照射下发荧光 、非蓝色且非绿色菌落 ； c） 紫外灯照射下不发荧光 、红褐色菌落 。 注： 避免滤膜上菌落长时间在紫外灯下照射 ，否则可能将菌杀灭 ，导致无法进行确证性试验 。 9.3 营养琼脂纯化 根据不同形态可疑菌落数量 ，按比例挑取 10个可疑菌落 （不足 10个则全挑 ） ，划线接种于营养琼脂 培养基上 ，36 ℃± 1 ℃培养 20 h~24 h，按下述步骤进行可疑菌落鉴定 。 9.4 细菌模板 DNA的提取 使用接种环刮取营养琼脂平板上的菌落 2个~10个，悬浮于 200 μL无菌生理盐水 ，旋涡混匀 ，8 000 g 离心 5 min，吸弃上清液 ，加入 50 μL DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀 ，快速吸取 ） ，混匀后沸水 浴5 min，12 000 g离心 5 min，取上清保存于 -20 ℃备用。 也可使用等效的商业化 DNA提取试剂盒并按说明制备模板 DNA。 9.5 DNA浓度和纯度的测定 样品 DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm和280 nm处的吸收值 ，按照式（1） 计算 DNA的浓度。 ρ=A260×50　　　　　　…………………………… （ 1 ） 式中： ρ——DNA浓度，单位