中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口食品及加工环境中李斯特菌属 计数方法 Enumeration of Listeria spp. in exported food and processing environmentICS 67.050 CCS X 04 2025 ‑12‑11发布 2026 ‑07‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5875—2025SN/T 5875—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：中华人民共和国济南海关 、中华人民共和国青岛海关 、北京陆桥技术股份有限公 司、中华人民共和国合肥海关 。 本文件主要起草人 ：赵晗、段效辉、郝莹、于娟娟、许文娟、姚静、史青、刘秀丽、贾俊涛、韩芳、刘娟娟、 黄小华、王云霞、丛中笑、徐娟。 ⅠSN/T 5875—2025 出口食品及加工环境中李斯特菌属 计数方法 1 范围 本文件描述了出口食品及加工环境中李斯特菌属的计数方法 。 本文件适用于出口食品和加工环境中李斯特菌属的菌落计数 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 李斯特菌属　 Listeria spp. 包括单核细胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes ） 、绵羊李斯特菌 （Listeria ivanvii ） 、英诺克李斯 特菌（Listeria innocua ） 、威尔斯李斯特菌 （Listeria welshimeri ） 、西尔李斯特菌 （Listeria seeligeri ）和格氏李 斯特菌（Listeria grayi ） 。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外 ，其他设备和材料如下 。 4.1 恒温培养箱 ：25 ℃± 1 ℃、36 ℃± 1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃~ 8 ℃。 4.3 无菌涂抹棉签或其他涂抹材料 。 4.4 拍击式均质器 。 4.5 振荡器。 4.6 显微镜物镜 ：10×~ 100×，如有条件可配相差显微镜 。 4.7 天平：感量 0.1 g。 4.8 无菌移液管 ：1 mL（具0.01 mL刻度） 、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头 。 4.9 无菌培养皿 ：直径 90 mm（或其他商业用一次性无菌平皿 ） 。 4.10 无菌涂布棒 。 4.11 载玻片和盖玻片 。 1SN/T 5875—2025 5 培养基和试剂 5.1 缓冲蛋白胨水 （BPW） ：见附录 A中A.1。 5.2 无抑制剂的 Fraser肉汤：见A.2。 5.3 ALOA李斯特菌琼脂培养基 ：见A.3。 5.4 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂 （TSA‑YE ） ：见A.4。 5.5　含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤 （TSB‑YE ） ：见A.5。 5.6 革兰氏染色液 ：见A.6。 5.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水 （VP试验用） ：见A.7。 5.8 过氧化氢试剂 ：见A.8。 6 检验程序 李斯特菌属平板计数程序见图 1。当按照本程序检测时 ，测定每克 、每毫升或每平方厘米的李斯特 菌属菌落形成单位 （CFU）数。 2/F @-@O  E    EE4/F+ "U . "-0" '8)6   25
gUmL U 225 mL /F"U=L" U @ L/+ "/UUB 36 ℃±1 ℃U24 h48 h 图1　李斯特菌属平板计数程序 7 操作步骤 7.1 样品制备和稀释 7.1.1 食品：以无菌操作称取样品 25 g（mL） ，放入盛有 225 mL缓冲蛋白胨水或无抑制剂的 Fraser肉汤 的无菌均质袋 （或均质杯 ）内，在拍击式均质器上连续均质 1 min~ 2 min或以 8 000 r/min~ 10 000 r/min 均质 1 min~ 2 min，混合均匀 ，制成 1∶10的样品匀液 。 7.1.2 需表面涂拭检测的样品 ：以无菌操作将灭菌后的涂抹棉签或其它材料 ，例如，滤纸片、涂抹海绵等 ， 蘸取缓冲蛋白胨水或无抑制剂的 Fraser肉汤，在确定的采样面积内横竖往返涂抹各 5次，放回其蘸取的 稀释液中 。折断涂抹材料根部 （如果有）让棉签完全浸入稀释液中 ，振荡或反复挤压使其成为初始样品匀 液。注意手不应触碰落入稀释液中的材料部分 。将混合液置于室温 （20 ℃~ 30 ℃）1 h~1.5 h，以修复损 2SN/T 5875—2025 伤的李斯特菌 。记录下单位涂抹面积对应初始样品匀液的体积 ，例如，涂抹 25 cm2的表面，浸入 25 mL 稀释液，1 mL初始样品匀液代表 1 cm2的涂抹面积 。 7.1.3 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取样品匀液 ，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL缓冲蛋白胨水或无抑 制剂的 Fraser肉汤的无菌试管中 （注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面 ） ，振摇试管或换用 1支1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀 。根据对样品污染状况的估计 ，按前述操作 ，依次制成 10倍系列稀释样 品匀液。每递增稀释一次 ，换用 1次1 mL无菌吸管或吸头 。 7.2 样品接种和培养 每个稀释度的样品匀液分别吸取 1 mL，以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量分别加入 3个ALOA李 斯特菌琼脂平板 ，尽快用无菌涂布棒涂布整个平板 ，注意不应触及平板边缘 。使用前，如琼脂平板表面有 水珠，可放在 25 ℃~ 50 ℃的培养箱里干燥 ，直到平板表面的水珠消失 。 在通常情况下 ，涂布后将平板静置 10 min，如样液不易吸收 ，可将平板放在培养箱 36 ℃± 1 ℃培养 1 h； 等样品匀液吸收后翻转平皿 ，倒置于培养箱 ，36 ℃± 1 ℃培养 24 h~48 h。 7.3 典型菌落计数和确认 7.3.1 李斯特菌属在 ALOA李斯特菌琼脂平板上的菌落为蓝绿色菌落 ，有或无不透明光环 。 7.3.2 选择有典型李斯特菌属特征菌落的平板 ，且同一稀释度 3个平板所有菌落数合计在 15 CFU~ 150 CFU之间的平板 ，计数典型菌落数 。 7.3.3 从典型菌落中任选 5个菌落（小于 5个全选），划线转接于 TSA‑YE 平板，于36 ℃± 1 ℃培养 18 h~24 h，对新鲜纯培养物进行确证试验 。 ——染色镜检 ：李斯特菌属为革兰氏阳性短杆菌或球杆菌 。 ——过氧化氢酶试验 ：挑取纯培养的单个典型菌落于洁净载玻片上 ，滴加 1滴3%的过氧化氢溶液 ， 如果在 30 s内出现气泡则为阳性 。李斯特菌属呈过氧化氢酶阳性反应 。 ——VP试验：将纯培养的单个典型菌落接种于 1 mL缓冲葡萄糖蛋白胨水中 ，36 ℃± 1 ℃培养 48 h。 加入 6% α‑萘酚 ‑乙醇溶液 0.5 mL和40%氢氧化钾溶液 0.2 mL，充分振摇试管 ，10 min~ 30 min 内观察结果 ，出现红色为阳性反应 。李斯特菌属呈 VP阳性反应 。 ——25 ℃生长的运动性试验 （可选） ：挑取纯培养的单个典型菌落接种于 TSB ‑YE肉汤，25 ℃± 1 ℃ 培养 8 h~24 h，直至培养基变浑浊 。用接种环将菌液滴到洁净载玻片上 ，压上盖玻片 ，在油镜 或相差显微镜下观察 ，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动 。球菌、大型杆状菌或游动迅速的杆 状菌不属于李斯特菌属 。 8 结果计算 8.1 若只有一个稀释度的平板菌落数在 15 CFU~ 150 CFU之间且有典型菌落 ，计数该稀释度平板上的 典型菌落 ，按8.7中式（1）计算。 8.2 若所有稀释度的平板菌落数均小于 15 CFU且有典型菌落 ，应计数最低稀释度平板上的典型菌落 ， 按8.7中式（1）计算。 8.3 若某一稀释度的平板菌落数大于 150 CFU且有典型菌落 ，但下一稀释度平板上没有典型菌落 ，应 计数该稀释度平板上的典型菌落 ，按8.7中式（1）计算。 8.4 若所有稀释度的平板菌落数均大于 150 CFU且有典型菌落 ，应计数最高稀释度平板上的典型菌 落，按8.7中式（1）计算。 8.5　若所有稀释度的平板菌落数均不在 15 CFU~ 150 CFU之间且有典型菌落 ，其中一部分小于 15 CFU或大于 150 CFU时，应计数最接近 15 CFU或150 CFU的稀释度平板上的典型菌落 ，按 3SN/T 5875—2025 8.7中式（1）计算。 8.6 若2个连续稀释度的平板菌落数均在 15 CFU~ 150 CFU之间，按8.7中式（2）计算。 8.7　计算公式 式（1） ： T=AB Cd……………………… …（ 1 ） 式中： T——样品中李斯特菌属菌落数 ； A——某一稀释度典型菌菌落的总数 ； B——某一稀释度确证为李斯特菌属的菌落数 ； C——某一稀释度用于李斯特菌属确证试验的菌落数 ； d——稀释因子 。 式（2） ： T=A1B1/C1+A2B2/C2 1.1d………………………… （ 2 ） 式中： T——样品中李斯