中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法 实时荧光逆转录重组酶介导链替换核酸 扩增法（实时荧光 RT‑RAA 法） Qualitative detection of Norovirus and hepatitis A virus in food for export — Real‑time reverse transcription recombinase‑aid amplification method （Real‑time RT‑RAA ） 2025 ‑12‑11发布 2026 ‑07‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5872—2025ICS 07.100.30 CCS X 04SN/T 5872—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：拱北海关技术中心 、广东产品质量监督检验研究院 、中国海关科学技术研究中心 、 珠海粤港食品安全检测有限公司 。 本文件主要起草人 ：姚丽锋、张娟、张晴阳、王小玉、魏海燕、麻丽丹、冯家望、黎财慧、游淑珠、唐食明、 曾俊洁、李清岚。 ⅠSN/T 5872—2025 出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法 实时荧光逆转录重组酶介导链替换核酸 扩增法（实时荧光 RT‑RAA 法） 1 范围 本文件描述了出口食品中诺如病毒 GⅠ、GⅡ型和甲肝病毒的实时荧光 RT‑RAA 检测方法 。 本文件适用于贝类 、生食蔬菜 、软果、硬质表面食品中诺如病毒 GⅠ、GⅡ型和甲肝病毒的定性检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 GB 4789 .42　食品安全国家标准　食品微生物学检验　诺如病毒检验 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 27403　实验室质量控制规范 　食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 实时荧光 RAA　real‑time RAA 重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术 。利用从细菌或真菌中获得的重组酶 ，在恒温下 （一般 为37 ℃~ 42 ℃） ，该重组酶可与引物紧密结合 ，形成酶和引物的聚合体 ，在单链 DNA结合蛋白的帮助 下，打开模板 DNA的双链结构 ，当引物在模板上搜索到与之完全匹配的互补序列时 ，在DNA聚合酶的 作用下，形成新的 DNA互补链，扩增产物以指数级增长 。利用荧光探针的标记 ，随着 RAA反应进行 ， RAA产物与荧光信号的增长呈现对应关系 。 注： 简称 RAA技术。 3.2 实时荧光 RT‑RAA real‑time reverse transcription RAA 在RAA技术基础上 ，体系中加入逆转录酶 ，在同一管中完成逆转录和 RAA试验，实现对 RNA模 板进行实时荧光逆转录检测的技术 。 3.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数 。 3.4 T 值 time threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所需要的时间 。 1SN/T 5872—2025 3.5 过程控制物质 process control 通过添加与目的病毒类似的外源质控物质 （如MS2噬菌体）来监测检测过程 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 BHQ 1：黑洞淬灭基团 1（black hole quencher 1） BS‑recA ：枯草芽孢杆菌重组酶 （Bacillus subtilis recombinase ） Bsu：枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis ） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate ） EDTA：乙二胺四乙酸 （ethylene diaminetetraacetic acid ） Exo Ⅲ：核酸外切酶 Ⅲ（Exonuclease Ⅲ） FAM：6‑羧基荧光素 （6‑carboxyfluorescein ） HAV：甲肝病毒 （Hepatitis A virus ） NV：诺如病毒 （Norovirus ） PEG：聚乙二醇 （polyethylene glycol ） PFU：噬菌斑形成单位 （plaque forming unit ） RT‑RAA ：逆转录 -重组酶介导链替换核酸扩增 （reverse transcription‑recombinase‑aid amplification ） SC‑recA ：天蓝色链霉菌重组酶 （Streptomyces coelicolor recombinase ） THF：四氢呋喃 （tetrahydrofuran ） Tricine：三（羟甲基）甲基甘氨酸 ｛N‑[Tristan (hydroxymethyl ）methyl ]glyine｝ Tris：三（羟甲基）氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl ）aminomethane ] 5 技术原理 以提取的病毒 RNA为模板，采用 GⅠ、GⅡ型诺如病毒和甲肝病毒各自的特异性片段 ，设计实时荧 光RT‑RAA 引物和 exo探针，进行实时荧光 RT‑RAA 扩增，根据规定时间内实时荧光 RT‑RAA 的荧光 增幅情况 ，实现对食品中 GⅠ、GⅡ型诺如病毒和甲肝病毒的快速检测 。 6 试剂和材料 除有特殊说明外 ，所有试验用试剂均为分析纯 ，试验用水符合 GB/T 6682一级水的要求 。所有试剂 均用无 RNase污染的容器分装 。 6.1 试剂 6.1.1 20% PEG。 6.1.2 280 mmol/L 乙酸镁。 6.1.3 实时荧光 RT‑RAA 扩增预混液 ：2.5 mmol/L dNTP 、225 ng/ μL单链结合蛋白 、300 ng/ μL recA重 组酶蛋白 （SC‑recA/BS‑recA ） 、75 ng/ μL Bsu DNA聚合酶、75 ng/ μL Exo Ⅲ核酸外切酶 ，150 ng/ μL逆转 录酶、250 mmol/L Tricine 、12.5 mmol/L 二硫苏糖醇 、250 ng/ μL肌酸激酶 。也可采用等效的商品化试剂 盒代替。 2SN/T 5872—2025 6.1.4 Trizol试剂：见附录 A的A.2.2。 6.1.5 75%乙醇：见A.2.3。 6.1.6 过程控制物质 ：制备及定量方法见附录 B。 6.2 检测用引物和探针序列 过程控制物质和待检病毒引物探针序列见表 1，扩增序列见附录 C。 表1　检测用引物和探针序列 病毒名称 GⅠ型NV GⅡ型NV HAV MS2噬菌体 　　注1： 简并引物 ：核苷酸链中除出现正常的 A、T、C、G 4种碱基符号外还出现如 R、Y、M等其他字母 ，其中 R=A/G ； Y=C/T ，M=A/C ；K=G/T ；W=A/T 。 　　注2： F为上游引物 ，R为下游引物 ，P为探针，FAM‑dT 、THF、BHQ 1‑dT和C3 spacer均为探针修饰基团 。引物和探针序列 （5’→3’'） F：CTRTCWGAAGTCACWGGCTTAKCMCCYGATG R：GTGGGTTTTGAKCCATAYTCTYTTAGAACTTG P：CTTAYTTYTCMTTYTATGGTGATGATGARA‑ (FAM‑dT ） ‑(THF）‑G‑(BHQ 1‑dT）‑CTCAACAGATATT‑C 3 Spacer F： CCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAG R： CATTGTTGACCTCTGGGACGAGGTTGGCTGC P：GATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAA‑ (FAM‑dT ） ‑(THF）‑（BHQ 1‑dT）‑GGCTCCCAGTTTTG‑C 3 Spacer F：ATTAGCATGGAGCTGTAGGAGTCTAAATTG R：CACCCGTAGCCTACCYCTTGTGGAAGATCA P：ACRCAGATGTTKGGRACGTCACCTTGCAG‑ （FAM‑dT ） ‑（THF）‑（BHQ 1‑dT）‑TAACTTGGCTYTCA‑C 3 Spacer F：CAGGTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTAC R：CTGACGTACGGCTCTCATAGGAAGAAACTC P：CAGTTCGGTTGGTTACCACTAATGAGTGA （FAM‑dT ） （THF） （BHQ 1‑dT）CCAGGGTGCATATGA‑C 3 Spacer扩增片段大 小/bp 149 160 119 118参考毒株基因序 列号及扩增序列 位置 GenBank 登录号： MZ022025 .1 （361‑509） GenBank 登录号： MW 686657 .1 （159‑318） GenBank 登录号： AM910900 .1 （135‑253） GenBank 登录号： JF719