中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口茯砖茶冠突散囊菌平板计数 Plate count of Eurotium cristatum in Fu Zhuan Tea for exportICS 67.050 CCS X 04 2025 ‑12‑11发布 2026 ‑07‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5865—2025SN/T 5865—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：厦门海关技术中心 、厦门市江平生物基质技术股份有限公司 、福建省泉州市裕园茶 业有限公司 、咸阳泾渭茯茶有限公司 、杭州海关技术中心 、漳州城市职业学院 、漳州市隆泰农业开发有限 公司、湖南中茶茶业有限公司 。 本文件主要起草人 ：周赞虎、彭小莉、李可、方靓、徐敦明、陈泳、郑俊超、林杨闻、黄伙水、韩阿火、林俊杰、 曾丹磊、庄燕煌、张帆、胡歆、张樟。 ⅠSN/T 5865—2025 出口茯砖茶冠突散囊菌平板计数 1 范围 本文件描述了出口茯砖茶冠突散囊菌计数方法 。 本文件适用于茯砖茶冠突散囊菌计数 ，其他产品参照本方法检验 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8302　茶　取样 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 27403　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1.1 实时荧光 PCR　real‑time polymerase chain reaction 实时荧光聚合酶链式反应 。 注： 是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团 ，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，荧光信号的强弱直接 反映模板数量 。 3.1.2 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 bp：碱基对（base pair） DEPC：焦碳酸二乙酯 （diethypyrocarbonate ） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核苷三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate ） dUTP：脱氧尿苷三磷酸 （deoxyuridine triphosphate ） EDTA：乙二胺四乙酸 （ethylenediaminetetraacetic acid ） ITS1：rRNA 基因与 5.8S rRNA 基因间的内转录 1区（internal transcribed spacer‑ 1） 1SN/T 5865—2025 PCR：聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ） RBP 1：RNA聚合酶 Ⅱ亚基 1（DNA‑directed RNA polymerase Ⅱ subunit 1） SDS：十二烷基硫酸钠 （Sodium Dodecyl Sulfate ） Taq：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase ） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷 ［tris（hydroxymethyl ）aminomethane ］ UNG酶：尿嘧啶 ‑N‑糖基化酶 （uracil‑N‑glycosylase ） 4 方法提要 本文件采用形态学和基因鉴定相结合方法 ，观察特定平皿上菌落形态 ，显微镜观察其孢子结构 ，同时 结合实时荧光 PCR技术鉴定冠突散囊菌 。以ITS1基因作为真菌的内源基因 ；RBP 1基因用于辅助属内 种的鉴定 。用所选择计数的每个平板上典型冠突散囊菌的菌落总数 ，乘以相应平板上已确认为冠突散囊 菌的菌落数与所挑取的代表性的菌落数之比 ，以此求出所选用的同一稀释度 2个计数平板上的冠突散囊 菌菌落数并计算平均值 ，再乘以该稀释倍数 ，得出冠突散囊菌数 。 5 试剂和材料 除有特殊说明外 ，所有实验用试剂均为分析纯 ；实验用水符合 GB/T 6682中一级水的要求 。 5.1 引物：扩增引物见表 1，扩增的靶标序列见附录 A。 表1　引物序列 基因 RPB 1 ITS1引物名称 RPB 1‑2‑F RPB 1‑2‑R Ls‑F 1‑F Ls‑F 1‑R序列（5’→3’） CTCTGAGAACCTGATTCTGGGT CGTAGGCGAGTAACTCAACGT CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG 5.2 10×ThermoPol 缓冲液：0.2 mol/L tris‑HCl 、0.1 mol/L氯化钾、0.1 mol/L硫酸铵、20 mmol/L 硫酸 镁、1% Triton X‑ 100。 5.3 dNTPs：每种核苷酸浓度 10 mmol/L 。 5.4 DNA提取液：0.2 mol/L Tris‑HCl （pH7.5） 、0.5 mol/L氯化钠、10 mmol/L EDTA 、1%（质量分数 ） SDS。 5.5 RNA酶液（10 mg/mL） 。 5.6 酚-三氯甲烷 -异戊醇混合液 （体积比，25∶24∶1） 。 5.7 三氯甲烷 -异戊醇混合液 （体积比，24∶1） 。 5.8 显色液：SYBR Green Ⅰ荧光染料 ，10 000×。 5.9 阳性对照 ：冠突散囊菌 CICC 2650，或含目的片段的 DNA。 5.10 1.5 mL离心管。 5.11 DEPC水：在1 000 mL去离子水中加入 100 µL DEPC ，静置过夜后高压灭菌 。 5.12 生理盐水 ：按附录 B中B.1。 5.13 孟加拉红琼脂 ：按B.2。 5.14 磷酸盐缓冲液 ：按B.3。 2SN/T 5865—2025 6 仪器和设备 6.1 培养箱：28 ℃± 1 ℃。 6.2 拍击式均质器及均质袋 。 6.3 电子天平 ：感量 0.1 g。 6.4 无菌锥形瓶 ：容量 500 mL。 6.5 无菌试管 ：18 mm× 180 mm。 6.6 旋涡混合器 。 6.7 无菌平皿 ：直径 90 mm。 6.8 移液器及枪头 ：量程 0.5 µL~ 10 µL；量程 10 µL~ 100 µL；量程 100 µL~ 1 000 µL。 6.9 高速台式离心机 ：≥7 000 g。 6.10 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。 6.11 接种钩。 6.12 研钵。 6.13 水浴锅。 7 检验程序 冠突散囊菌平板计数法检验程序见图 1。 
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I 图1　冠突散囊菌平板计数法检验程序 3SN/T 5865—2025 8 操作步骤 8.1 样品的准备 8.1.1 按照 GB/T 8302进行茶叶取样 。 8.1.2 样品的均质 ：取25 g样品至盛有 225 mL无菌稀释液 （蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液 ）的适宜 容器内（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ）或无菌均质袋中 ，充分振摇或用拍击式均质器拍打 1 min~ 2 min，制成 1∶10的样品匀液 。 8.1.3 取1 mL 1∶10样品匀液注入含有 9 mL无菌稀释液的试管中 ，另换 1支1 mL无菌吸管反复吹吸 ， 或在旋涡混合器上混匀 ，此液为 1∶100的样品匀液 。 8.1.4 按照 8.1.3操作，制备 10倍递增系列稀释样品匀液 。每递增稀释一次换用 1支1 mL无菌吸管 。 8.1.5 选择 2个~3个适宜稀释度的样品匀液 ，在进行 10倍递增稀释的同时 ，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液于 2个无菌平皿内 。同时分别取 1 mL无菌稀释液加入 2个无菌平皿作空白对照 。 8.1.6 及时将 20 mL~ 25 mL冷却至 46 ℃的孟加拉红琼脂 （可放置于 46 ℃± 1 ℃恒温水浴箱中保温 ）倾 注平皿，并转动平皿使其混合均匀 。置水平台面待培养基完全凝固 。 8.2 培养 琼脂凝固后 ，正置平板 ，置28 ℃± 1 ℃培养箱中培养 ，培养 5 d~7 d。 8.3 疑似菌落观察和记录 孟加拉红平板上黄色菌落为疑似菌落 ，在不开培养皿盖子的情况下 ，选择菌落数在 10 CFU~ 150 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板记录黄色疑似菌落数 ，低于 10 CFU的平板记录具体菌落数 ，大于 150 CFU 的可记录为多不可计 。 8.4 疑似菌落挑选及确认 8.4.1 通则 至少选 5个疑似菌落 （小于 5个全选） 。每个菌落都应进行以下 3种试验：三点法接种于孟加拉红平 板、显微镜检和实时荧光 PCR试验。 8.4.2 三点法接种 用接种针以三点法接种疑似菌落于孟加拉红平皿 ，培养 5 d；冠突散囊菌在孟加拉红平板上典型菌落 形态特征