ICS 71. 080. 99 G 17 HG 备案号：20517—2007 中华人民共和国化工行业标准 HG/T 39352007 哺乳类动物细胞培养基 Cell culture media 2007-04-13发布 2007-10-01实施 中华人民共和国国家发展和改革委员会 发布 HG/T 3935—2007 本标准附录A为资料性附录。 本标准由中国石油和化学工业协会提出。 本标准由全国化学标准化技术委员会有机分会（SAC/TC63/SC2)归口。 本标准由北京清大天一生物技术有限公司负责起草。 本标准主要起草人：陈文庆、罗海春。 HG/T3935-2007 哺乳类动物细胞培养基 1范围 本标准规定了哺乳类动物细胞培养基的要求、试验方法、检验规则及标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于哺乳类动物细胞培养基。该产品主要用于哺乳类动物细胞培养。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后的修 改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否 可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T191—2000包装储运图示标志（eqVIS0780：1997） GB/T1250极限数值的表示方法和判定方法 GB/T6679—2003固体化工产品采样通则 中华人民共和国药典2005年版二部附录 中华人民共和国药典2005年版三部附录 中华人民共和国药典2005年版二部纯化水 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 每升标示量markerliter 在产品包装上标注的配制1L液体细胞培养基所需干粉细胞培养基的质量，单位为g。 4分类和命名 哺乳类动物细胞培养基按主要成分的不同分为四型，其命名及对应主要成分见表1。 HG/T3935—2007 表1哺乳类动物细胞培养基型号命名及对应主要成分 型号命名： 主要成分 氰化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L-精氨酸盐酸 盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L DMEM粉末细胞培养基 氨酸、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、L-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆 醛、核黄素、盐酸硫胺 氟化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷 酸氢二钠、L-丙氨酸、L-精氮酸盐酸盐、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸 盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨 酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、 199粉末细胞培养基 L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫酸腺嘌呤、腺苷酸、脱氧核糖、D-葡葡糖、谷胱甘肽（还原型）、盐 酸鸟嘌呤、次黄嘌岭、酚红、D核糖、乙酸钠、胸腺啶、尿嘧啶、黄嘌呤、维生素C、维生 素E、维生素H、D-泛酸钙、氟化胆碱、叶酸、L-肌醇、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡 哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素A醋酸酯 氟化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L-精氨酸盐酸 盐、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、 MEM粉末细胞培养基 L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、 L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D葡萄糖、酚红、丁二酸、丁二酸钠、D泛酸钙、氟化胆 碱、叶酸、L-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺 四水硝酸钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天 亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏 RPM11640粉末细胞培养基 氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-葡萄糖、谷胱甘肽（还原型）、HEPES、酚红、维 生素H、D-泛酸钙、氨化胆碱、叶酸、L-肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄 素、盐酸硫胺、维生素Bi2 每一型号可根据配方不同分为若于亚型。 5性状 粉红色或类白色固体粉末。 6要求 哺乳类动物细胞培养基应符合表2所示的技术要求。 2 HG/T3935---2007 表2技术要求 指 标 项 目 DMEM 199 MEM RPMI1640 粉末细胞培养基 粉末细胞培养基 粉末细胞培养基 粉末细胞培养基 澄清度 pH值*(每升标示量/L) 3.20~6.40 3.90~6.30 3. 90~6. 90 6.40~8.30 干燥减量的质量分数/% 5. 0 238~299 渗透压/(mOsm/kgH20) 238~291 228~301 223~273 细菌内毒素/(EU/mL) 10 细菌数/(CFU/g) 200 微生物限度 霉菌数/(CFU/g) 50 细胞形态 正常 细胞生长试验 合格 细胞生长试验 每种亚型允许的pH偏差范围为士0.30。 b 每种亚型允许的渗透压偏差范围为士5%， 7试验方法 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国药典2005年版中规定的纯 化水。 7.1澄清度的测定 称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水1000mL，搅拌至溶解。按中华人民共 和国药典2005年版二部附录IXB进行。 7.2pH值的测定 称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水1000mL，搅拌至溶解。按中华人民 共和国药典2005年版附录VH进行。 7.3干燥减量的测定 按中华人民共和国药典2005年版二部附录IL干燥失重测定法进行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定 值的算术平均值的10%。 7.4渗透压的测定 称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水1000mL，搅拌至溶解。按中华人民 共和国药典2005年版二部附录区G渗透压摩尔浓度测定法进行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定 值的算术平均值的5%。 7.5细菌内毒素的测定 按中华人民共和国药典2005年版附录XIE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。 称取1/100每升标示量的实验室样品，精确至0.0001g，加入细菌内毒素检查用水（市售）10mL 溶解，吸取该溶液0.1mL加细菌内毒素检查用水（市售）3.9mL，混匀即得试验溶液。 7.6微生物限度的测定 按中华人民共和国药典2005年版附录X微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。 3 HG/T3935--2007 检查法采用平血法。 称取实验室样品1g，精确至0.01g，加人无菌纯化水10mL溶解，混匀即得试验溶液。 7.7细胞生长试验 7.7.1方法提要 7.7.1.1本试验所用容器具及溶液均为无菌，试验操作过程均为无菌操作。 7.7.1.2细胞在37℃恒温条件下，在含体积分数为10%小牛血清的细胞培养液中生长48h～72h， 观察细胞形态并进行细胞计数；细胞生长48h～72h后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养 48h，观察细胞形态并进行细胞计数。 7.7.2试剂和材料 7.7.2.1小牛血清：中华人民共和国药典2005年版三部附录XID。 7.7.2.2平衡盐溶液：称取氯化钾0.2g，精确至0.01g；无水磷酸二氢钾0.2g，精确至0.01g；氯化钠 即得。 7.7.2.3VERO细胞：代次不超过150代。 7.7.2.4细胞培养液：按产品使用说明书要求配制。 混匀、过滤除菌即得。 7.7.3仪器 7.7.3.1E 医用净化工作台：洁净级别为百级。 7.7.3.2 （37士1）℃恒温。 7.7.3.3细胞培养瓶：T25型、无菌。 7.7.3.4 显微镜：倒置、相差。 7.7.3.5 血球计数板， 7.7.3.6 盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。 7.7.4试验步骤 7.7.4.1制备细胞悬液 7.7.4.1.1将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出，用平衡盐溶液洗细胞一次。 7.7.4.1.2向细胞培养瓶内加人胰蛋白酶溶液1mL，于（37土1）℃消化3min～5min。在显微镜下观 察，当细胞变圆接近脱壁时，将胰蛋白酶溶液倒掉。 7.7.4.1.3根据细胞密度加入一定量细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱壁制成细胞悬液A。 7.7.4.2细胞培养 7.7.4.2.1吸取一定量的细胞悬液A，加到细胞培养瓶内。 为5×104细胞/mL。 0.1）%条件下进行培养。 7.7.4.2.4培养48h～72h，观察细胞形态，并按7.7.4.3计数。 7.7.4.2.5当细胞密度达到1×105细胞/mL时更换不含小牛血清的细胞培养液10mL，继续培养 48h，观察细胞形态并计数。 7.7.4.3细胞计数 7.7.4.3.1将需要计数的细胞按7.7.4.1方法制备细胞悬液B。 7.7.4.3.2吸取细胞悬液B100μL转移至离心管中，视细胞量确定是否稀释及稀释倍数。 4 HG/T3935—2007 7.7.4.3.3将盖玻片盖于计数板中心的计数室上方。调整计数板中的细胞数量在100个～300 个。沿盖玻片边缘点加细胞悬液使其通过毛细作用自然渗人，不要留有气泡，不要外溢，显微镜下 计数。 7.7.4.3.4观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，一般遵循“计左不计右，计上不计下”的 原则。将计数板观察细胞数代人下列公式： 计数板