QB/T 8139－2025 中 华 人 民 共 和 国 轻 工 行 业 标 准 饮料中维生素 B12的测定 高效液相色谱法 QB/T 8139－2025 * 中国轻工业出版社出版发行 地址：北京鲁谷东街 5号 邮政编码： 100040 发行电话： (010)85119832 网址： http://www.chlip.com.cn Email：[email protected] 轻工业标准化编辑出版委员会编辑 地址：北京西城区月坛北小街 6号院 邮政编码： 1000 37 电话：(010)68049923 * 版权所有 侵权必究 书号： 155019· 7112 印数： 1－200册 定价： 23. 00元 ICS 67.050 CCS X 04 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T 8139－2025 饮料中维生素 B12的测定 高效液相色谱法 Determination of vitamin B 12 in beverages —High performance liquid chromatography 2025-04-10发布 2025-11-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T 8139－2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 －2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中国轻工业联合会提出。 本文件由全国食品工业标准化技术委员会（ SAC/TC 64 ）归口。 本文件起草单位：广东省食品工业研究所有限公司 （国家轻工业食品质量监督检测广州站） 、捷通 （广州）检测技术服务有限公司、山西和耀科技有限公司、东鹏饮料（集团）股份有限公司、江苏广海 检验检测有限公司、绿城农科检测技术有限公司、东莞市南北检测认证技术有限公司、拜发分析系统销 售（北京）有限公司、翁源广业清怡食品科技有限公司。 本文件主要起草人：林丹、刘春丽、顾秀英、胡海娥、段文华、何焜鹏、何晓军、贺丽丽、贝荣廷、 范康福、谢颖君、段凯耀、李学莉、陈俊辉、吴凯薇、蓝方存、李柳基、区玉芳、陈奇、李嘉鸿、冯志 强、曾健莹、刘文剑。 本文件为首次发布。 QB/T 8139－2025 1 饮料中维生素 B12的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件描述了饮料中维生素 B12的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于饮料（不含动物源性成分）中维生素 B12含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中维生素 B12经免疫亲和柱净化、富集后，采用液相色谱仪分离检测，外标法定量。 5 试剂和材料 除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 甲醇（ CH 3OH）：色谱纯。 5.1.2 乙醇（ C2H6O）：色谱纯。 5.1.3 氢氧化钠（ NaOH）。 5.1.4 磷酸（ H3PO 4）。 5.1.5 三氟乙酸（ CF3COOH）。 5.1.6 乙酸钠（ CH 3COONa）。 5.2 标准物质 维生素 B12标准物质 （CAS号： 68-19-9）：纯度不小于 99%，或经国家认证并授予标准物质证书的 标准物质。 5.3 试剂配制 QB/T 8139－2025 2 5.3.1 氢氧化钠溶液（ 1 mol/L）：称取 4.0 g氢氧化钠于烧杯中，加适量水溶解后，转移至 100 mL容 量瓶中，用水稀释并定容。 5.3.2 磷酸溶液（ 0.05%，体积比）：移取 0.5 mL磷酸于 1000 mL 容量瓶中，用水稀释并定容。超声 10 min备用。 5.3.3 三氟乙酸溶液（ 0.04%，体积比） ：量取 500 mL水，加入 200 μL三氟乙酸 ，混匀。 5.3.4 乙酸钠缓冲液 （0.25 mol/L ）：称取 20.5 g无水乙酸钠 ，用950 mL水溶解并用乙酸调 pH至4.0±0.1， 用水稀释并定容至 1 000 mL容量瓶中。 5.3.5 维生素 B12标准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取维生素 B12标准物质（ 5.2）10 mg（精确至 0.000 01 g） 于10 mL棕色容量瓶，用乙醇溶解并定容至刻度线，摇匀转移至棕色试剂瓶，于 -20 ℃下避光保存。有 效期 6个月。 5.3.6 维生素 B12中间液（ 1 000 ng/mL ）：移取维生素 B12标准储备液（ 5.3.5）0.05 mL于50 mL棕色 容量瓶中，用水定容至刻度线。有效期 1周。 5.3.7 维生素 B12标准工作液：分别移取适量维生素 B12中间液（ 5.3.6）用水逐级稀释成质量浓度为 10 ng/mL ，20 ng/mL ，50 ng/mL ，100 ng/mL ，300 ng/mL ，500 ng/mL 的标准工作液，现用现配。 5.4 材料 5.4.1 滤膜： 0.22 μm，0.45 μm水相。 5.4.2 免疫亲和净化柱：维生素 B12免疫亲和柱（ ESAI-EXTRACT®VITAMIN B 12）1)或性能相当 （柱容量及柱回 收满足附录 A）。 5.4.3 玻璃纤维滤膜。 5.5 仪器和设备 5.5.1 高效液相色谱仪：带紫外或二极管阵列检测器 。 5.5.2 电子分析天平：感量 0.001 g和0.000 01 g 。 5.5.3 超声波清洗仪：温度范围 10 ℃～80 ℃。 5.5.4 涡旋混合器：最高转速不低于 500 r/min 。 5.5.5 氮吹仪：气体流量不低于 1 L/min。 6 测定步骤 6.1 试样制备 6.1.1 液体饮料 取多个预包装的饮料样品直接均匀混合（碳酸饮料超声 10 min，去除 CO 2，备用）。 6.1.2 固体饮料 样品需粉碎、研磨并搅拌均匀，称取 10 g～25 g（精确至 0.001 g）样品，用适量水溶解，转移至 500 mL棕色容量瓶，并用水定容至刻度，备用。 6.2 提取与净化 6.2.1 提取 1) 给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可以使用这些等效的产 品。 QB/T 8139－2025 3 6.2.1.1 液体饮料 称取 6.1.1中50 g（精确至 0.001 g）或准确吸取 50 mL试样（ 6.1.1）于 100 mL比色管中。用氢氧化钠 溶液（ 5.3.1）调整 pH至5～7，涡旋混匀、过玻璃纤维滤膜、待净化。操作过程应避光操作。 6.2.1.2 固体饮料 称取 6.1.2中50 g（精确至 0.001 g）或准确吸取 50 mL试样（ 6.1.2）于 100 mL比色管中 。用氢氧化钠 溶液（ 5.3.1）调整 pH至5～7，涡旋混匀 、过玻璃纤维滤膜、 待净化。 操作过程应避光操作。 6.2.2 净化 将免疫亲和柱 连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，将 （6.2.1）试样全部样液过 柱（其中含维生素Ｂ 12为10 ng～500 ng），调节过柱速度为 2 mL/min ～3 mL/min 。待样液完全过柱后， 用10 mL水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置 10 mL玻璃比色管，用 3 mL甲醇分 3 次洗脱，收集全部洗脱液，在 40 ℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用磷酸溶液（ 5.3.2）定容至 1.0 mL， 涡旋 30 s溶解残留物， 0.22 μm水相滤膜过滤，待测。 操作过程应避光操作。 6.3 色谱参考条件 6.3.1 色谱柱： C18（4.6 mm×250 mm，5 µ m），或具有同等性能的色谱柱。 6.3.2 流速： 1 mL/min 。 6.3.3 柱温： 30 ℃。 6.3.4 进样体积： 100 µ L。 6.3.5 检测波长： 361 nm。 6.3.6 流动相： 流动相 A为0.05%磷酸溶液， 流动相 B为甲醇，梯度洗脱见表 1。 表1 梯度洗脱 时间 /min 流动相 A/（%） 流动相 B/（%） 0 90 10 4 90 10 9 35 65 15 0 100 20 90 10 23 90 10 7 测定 将维生素 B12标准工作溶液 （5.3.7）和试液（ 6.2.2）注入色谱柱，得到色谱峰面积响应值，用外标 法定量测定。标准溶液色谱图和试样色谱图见附录 B。 8