! 7 ,     江苏省市场监督管理局 发 布 中 国 标 准 出 版 社 出 版高粱品种鉴定　 IDP分子标记法 Identification of sorghum varieties ——IDP marker method 2025 ‑12‑30发布 2026 ‑01‑30实施CCS B 21 DB32/T 5295 —2025ICS 65.020.01DB32/T 5295 —2025 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语、定义和缩略语 ………………………………………………………………………………………… 1 4 仪器设备及试剂 …………………………………………………………………………………………… 2 5 溶液配制 …………………………………………………………………………………………………… 2 6 鉴定位点及使用 …………………………………………………………………………………………… 2 7 参照品种及使用 …………………………………………………………………………………………… 2 8 操作程序 …………………………………………………………………………………………………… 2 9 结果统计 …………………………………………………………………………………………………… 4 10 结果判定 …………………………………………………………………………………………………… 4 附录 A（规范性） 主要仪器设备及试剂 ……………………………………………………………………… 6 附录 B（规范性） 溶液配制 …………………………………………………………………………………… 8 附录 C（规范性） 鉴定位点名单 …………………………………………………………………………… 10 附录 D（资料性） 鉴定位点相关信息 ……………………………………………………………………… 12 附录 E（资料性） 参照品种名单及来源 …………………………………………………………………… 15目 次 ⅠDB32/T 5295 —2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由江苏省农业农村厅提出并组织实施 。 本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口 。 本文件起草单位 ：江苏省农业科学院 、中国农业科学院 、贵州省旱粮研究所 。 本文件主要起草人 ：钟小仙、薛文韬、朱莉、高杰、刘智微、陈晓强。 ⅢDB32/T 5295 —2025 高粱品种鉴定　 IDP分子标记法 1 范围 本文件规定了利用核苷酸插入缺失多态性 （IDP：Insertion‑deletion polymorphism ）分子标记进行高粱 （Sorghum ）品种 DNA指纹鉴定的仪器设备及试剂 、溶液配制 、鉴定位点及使用 、参照品种及使用 、操作程 序、结果统计及结果判定 。 本文件主要适用于粒用高粱中的 DNA分子数据采集和品种鉴定 ，甜高粱、苏丹草、高丹草、拟高粱 在内的饲用高粱品种鉴定也可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T 3543 .2　农作物种子检验规程　第 2部分：扦样 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2467　高粱品种鉴定　 SSR分子标记法 NY/T 2594　植物品种鉴定　 DNA分子标记法　总则 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 NY/T 2594界定的术语和定义适用于本文件 。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 bp：碱基对（base pair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 （cetyltrimethylammonium bromide ） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate ） EDTA：乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid ） HEX：六氯荧光素 （HEX NHS ester ） IDP：插入缺失多态性 （insertion‑deletion polymorphism ） PCR：聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ） ROX：马来酰亚胺 （X‑Rhodamine maleimide ） Taq酶：耐热 DNA聚合酶（Taq‑DNA polymerase ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸 （Tris‑acetate‑EDTA ） TAMRA ：罗丹明荧光素 （Carboxytetramethylrhodamine ） 1DB32/T 5295 —2025 TE：三羟甲基氨基甲烷 -乙二胺四乙酸 （Tris‑EDTA ） TD‑PCR ：降落 PCR（Touch‑down PCR ） Tris：三羟甲基氨基甲烷 ［Tris（hydroxymethyl ）methyl aminomethane THAM ］ 6‑FAM：6‑羧基荧光素 （6‑Carboxy‑fluorescein ） 4 仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂 按附录 A。 5 溶液配制 溶液配制方法 按附录 B。 6 鉴定位点及使用 鉴定位点引物序列及相关信息见附录 C和附录 D。利用琼脂糖凝胶电泳检测时选择普通引物 ；利 用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物 ，荧光标记位于正向引物 5'端，荧光标记推荐使用 6‑FAM， 允许配合 HEX、TAMRA 、ROX其他三色荧光标记多重电泳 。构建数据库时 ，应使用全部引物 ；在品种 鉴定时，利用附录 C中的引物序贯检测 ，当检测到的差异位点数能判定送检样品与参照品种不同时 ，即 可停止检测 。 7 参照品种及使用 参照品种包括 BTx 623、Rio、Tx430、红缨子、晋糯 3号、红糯 16、苏丹草 2098和苏牧 3号（拟高粱 × 苏丹草杂交种 ） ，参照品种在以上引物的扩增片段中至少有一个品种与其他不同 。参照品种用于辅助确 定送检样品在某个位点的等位变异 ，宜与送检样品同时检测 。参照品种及相关信息见附录 D和附录 E。 8 操作程序 8.1 样品准备 送检样品可为种子 、幼苗、根、茎、叶等新鲜组织 。每份样品不少于 30个个体植株或种子 ，等量混合 分析，必要时进行个体检测 。种子样品需扦样时 ，应符合 GB/T 3543 .2的规定。 8.2 DNA 提取 称取 500 mg四叶期幼苗新鲜叶片 ，用液氮冷冻后迅速磨成粉末 ；或称取 500 mg种子，常温下研磨 成粉末后 60目过筛。以幼苗叶片粉末或 100 mg过筛种子粉末为样品进行 DNA提取，实验流程参照 NY/T 2467中步骤进行 。 注： 以上为推荐的 DNA提取方法 ，DNA质量能够满足 PCR扩增要求的其他 DNA提取方法均适用 。DNA溶液的 紫外吸光度 OD 260与OD 280的比值宜介于 1.7~2.0。 8.3 PCR 扩增 8.3.1 反应体系 PCR扩增反应体系参照 NY/T 2467中体系进行 。 2DB32/T 5295 —2025 8.3.2 反应程序 8.3.2.1 概述 PCR扩增反应程序采用降落式 TD‑PCR 程序，分为高退火和低退火 2个程序。 8.3.2.2 TD‑PCR 反应程序 1（高退火） 95 ℃ 5 min 95 ℃ 15 s 63 ℃ 15 s，ΔT=- 0.5 ℃/cycle 12 cycles 72 ℃ 20 s 95 ℃ 15 s 57 ℃ 15 s 30 cycles 72 ℃ 20 s 72 ℃ 5 min 8.3.2.3 TD‑PCR 反应程序 2（低退火） 95 ℃ 5 min 95 ℃ 15 s 60 ℃ 15 s，ΔT=- 0.5 ℃/cycle 12 cycles 72 ℃ 20 s 95 ℃ 15 s 54 ℃ 15 s 30 cycles 72 ℃ 20 s 72 ℃ 5 min 注1： 反应程序中三步循环时间可根据 PCR扩增仪型号 、酶、引物等在 5 s~20 s内进行调整 。 注2： 依据附录 D中的标注对不同引物使用相应的反应程序 。 8.4 基因分型平台 使用琼脂糖凝胶电泳平台进行基因分型时宜选择普通引物的 PCR产物，使用荧光毛细管电泳平台 进行基因分型时应选择带有荧光标记引物的 PCR产物。 8.4.1 琼脂糖凝胶电泳 8.4.1.1 制胶 称取 4 g琼脂糖于三角瓶中并加入 100 mL的1×TAE缓冲液，微波炉加热至沸腾后取出 ，稍冷却 后加入一定量核酸染料 （具体用量视核酸染料类型而定 ） ，摇匀后倒入水平制胶框 ，插上制样梳 。 8.4.1.2 电泳 将胶板安装于电泳槽上 ，在电泳正极槽和负极槽各加入适量 1×TAE缓冲液，使其没过点样孔 。移 液器吸取 6 μL~8 μL PCR产物