C 33 备案号：8598—2001 YY 中华人民共和国医药行业标准 YY/T 0127.9—2001 neqIS07405:1997 口腔材料生物学评价 第2单元：口腔材料生物试验方法 细胞毒性试验：琼脂覆盖法及分子滤过法 Biological evaluation of dental materials-- Part 2:Biological evaluation test method of dental materials Cytotoxicity tests:Agar diffusion test and filter dissusion test 2001-03-12发布 2001-08-01实施 国家药品监督管理局‧发布 YY/T0127.9—2001 前 言 本标准非等效采用国际标准化组织ISO7405一1997《牙科学 用于牙科的医疗器械生物相容性 临床前评价—牙科材料试验方法》。 本标准主要依据ISO7405：1997《牙科学一 用于牙科的医疗器械生物相容性临床前评价一牙 科材料试验方法》第6.1条“琼脂覆盖试验”及第6.2条“分子滤过试验”。为了便于操作，本标准在试验 操作中作了一些具体规定及编辑性修改。 本标准废除并替代YY91042一1999《牙科复合树脂充填材料》附录A中A2细胞毒性试验。本标准 较前版标准增加了琼脂覆盖法，且在试样制备及评价指标上有所不同。 本标准为YY0268一1995《口腔材料生物学评价第1单元：口腔材料生物性能评价导则》提供了 具体的方法。 本标准从实施之日起，同时代替YY91042-1999《牙科复合树脂充填材料》附录A中A2细胞毒性 试验。 本标准由国家药品监督管理局提出。 本标准由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。 本标准由国家药品监督管理局北医医疗器械质量监督检验中心负责起草。 本标准主要起草人：林红、刘文一、李盛琳。 YY/T0127.9—2001 ISO前言 本国际标准由ISO/TC106牙科技术委员会与世界牙科联盟（FDI)共同起草，它取代了ISO/TR 7405：1984，在技术上进行了修改，并转化成本国际标准。 此国际标准是有关用于牙科医疗器械的牙科材料的临床前试验。它是从ISO/TR7405：1984《牙科 材料生物学评价》及其附件发展而来，并取代ISO/TR7405。使用时应与ISO10993《医疗器械生物学评 价》系列标准结合使用。 此标准在许多重要方面与ISO/TR7405不同。首先它含有一些只针对牙科材料的具体的试验方 法。以前在ISO/TR7405中的许多试验方法现在已包含在ISO10993系列标准中，故在此标准中不包 含这些方法的细则。其次，仅仅是委员会成员国认为已有足够发表的资料的试验方法才包含在本标准 中。第三，推荐试验方法时，首先要考虑尽可能地减少使用动物的原则。 中华人民共和国医药行业标准 口腔材料生物学评价 第2单元：口腔材料生物试验方法 YY/T0127.9-2001 neqISo 7405:1997 细胞毒性试验：琼脂覆盖法及分子滤过法 代替YY91042--1999附录AA2 Biological evaluation of dental materials- Part 2:Biological evaluation test method of dental materials Cytotoxicitytests:Agardiffusiontestandfilterdissusiontest 1范围 本标准规定了牙科材料细胞毒性试验方法—琼脂覆盖法及分子滤过法。 本标准用于检测牙科材料在通过琼脂或琼脂糖扩散后或通过乙酸纤维素滤膜扩散后的非特异性细 胞毒性。 2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均 为有效。所有标准都会被修订，使用木标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T16886.5一1997医疗器械生物学评价第5部分：细胞毒性试验：体外法 ISO7405：1997牙科学—用于牙科的医疗器械生物相容性临床前评价——牙科材料试验方法 3细胞系 ATCCCCL1(NCTCclone929)[小鼠成纤维细胞］或ATCCCCL2(Hela)[人上皮细胞系」。如能证 明反应的重复性和精确性，也可选用其他细胞系。 注：其他替代细胞系见附录A。 4培养基及染色液 4.1培养基 4.1.1生长培养液 符合选定细胞系生长要求的含血清或无血清培养液。培养液中含对试验无影响的抗生素，pH7.2~ 7.4。用过滤法灭菌培养液。 ［如：制备1X培养基，将90mLEagle'sMEM(不含L-谷氨酰胺）的pH调至7.2，使用前加10mL 小牛血清，1mL100X非必要氨基酸(L-谷氨酰胺)和1mL抗菌素。」 4.1.2琼脂培养基 4.1.2.1制备2X生长培养液 配制双倍浓度的基础培养液（2×）。过滤法灭菌。［例如：将2倍量的Eagle'sMEM（不含L-谷氨酰 胺）溶于双蒸馏水中，加2mLL-谷氨酰胺（29.2mg/mL），调pH至7.2~7.4，加水至80mL，过滤灭 菌，加20mL小牛血清。 国家药品监督管理局2001-03-12批准 2001-08-01实施 1 YY/T0127.9—2001 4.1.2.23%琼脂或琼脂糖：用双蒸馏水配制3%琼脂或琼脂糖。高压蒸汽灭菌。 4.1.2.3琼脂培养基的制备：将3%琼脂或琼脂糖在水浴中加热至100℃，至琼脂或琼脂糖完全溶化为 止，然后冷却至48℃。将1份琼脂或琼脂糖与1份新配制的预热至48℃的2×生长培养液混合，使培养 基的最终浓度为1X生长培养基。 4.2制备染色液 4.2.1用于琼脂覆盖法的活体染色液的制备 4.2.1.11%中性红存贮液制备 称取中性红1g，用PBS液100mL溶解。置棕色瓶内，4℃冰箱贮存。 4.2.1.2活体染色液的制备 0.01%。中性红溶液应避光保存。 4.2.2用于分子滤过法的染色液的制备 4.2.2.1琥珀酸脱氢酶染色液 可选择以下两种方法制备琥珀酸脱氢酶染色液： 各存贮液的制备如下： a）琥珀酸盐液：琥珀酸钠13.6g，pH7.6的磷酸盐缓冲液100mL； b）氯化氮蓝四唑溶液：氯化氮蓝四唑溶液100mg，pH7.6的磷酸盐缓冲液100mL； c）甲基硫酸吩嗪液：甲基硫酸吩嗪4g，新配制的去离子水10mL。 4.2.2.1.2琥珀酸钠 0.06mol/l 4.0mL; 磷酸缓冲液 0.2mol/L 4.0mL; 林格氏液 2.0mL; 氯化氮蓝四唑(NitroBT) 0.2% 10 mL。 注：磷酸盐缓冲液(pH=7.2士2)： 磷酸二氢钠 0.2 mol/L 28 mL; 72 mL。 磷酸氢二钠 0.2 mol/L 4.2.2.2非特异性水解酶染色液 用非特异性水解酶染色时，制备双醋酸盐荧光素存贮液，即在1mL丙酮液中加人5mg双醋酸盐 荧光素。使用时取20μL存贮液加入到100mL磷酸盐缓冲液中。 5设备 5.1培养血：直径90mm的组织培养血（琼脂覆盖法）；直径50～60mm的培养皿（分子滤过法）。 5.2二氧化碳恒温培养箱。 5.3超净工作台。 5.4恒温水浴箱（100℃）。 5.5倒置光显微镜（琼脂覆盖法用）。 5.6直径47mm，孔径0.45μm的乙酸纤维素滤膜（分子滤过法用）。 6样本制备 6.1试样 6.1.1按厂家要求制备试样。按照GB16886.5第4章的规定对材料浸提液或试样进行试验。 在分子滤过法试验中，所有试样包括固体，均应放在滤膜上，试样的重量不大于3.5g。 6.1.2固体材料：制成直径约5mm，厚约2mm的圆片。一面光滑以保证与覆盖的琼脂（琼脂覆盖法） 2 YY/T 0127.9—2001 或滤膜（分子滤过法）紧密接触。 6.1.3固化类的材料：将刚调和的材料填人内径5mm、高5mm的玻璃或聚四氟乙烯环中。 6.1.4液体试样或浸提液：吸取0.1mL液体于直径为5mm的圆形硼硅酸盐微孔玻璃滤片、医用明胶 海绵或其他载体上（浸提液制备见GB16886.5一19974.2条）。 6.2对照样本 对照样本应符合GB16886.5-1997第3章的规定。 6.2.1阴性对照：直径约5mm、厚约2mm的氧化铝陶瓷或高密度聚乙烯圆片；或已证明无细胞毒性 的其他材料。样本表面光滑。所选阴性对照材料的细胞毒性为0级。 6.2.2阳性对照：含有机锡添加剂的聚氯乙烯或20%苯酚溶液浸湿的医用明胶海绵（琼脂覆盖法）。含 有机锡添加剂的聚氯乙烯或20%苯酚溶液浸湿的直径约为5mm的滤膜或涂有邻苯二甲酸脂的涤纶 薄膜（分子滤过法）。所选阳性对照材料的细胞毒性为≥2级。 6.2.3空对照（分子滤过法用）： 6.2.3.1含单层细胞但无试验材料的滤膜。 6.2.3.2不含细胞但接触试验材料的滤膜。 7试验步骤 7.1琼脂覆盖法 7.1.1培养细胞直至达到其对数生长期末细胞趋于融合。用胰蛋白酶和/或EDTA消化分散细胞。用 生长培养液配制成2.5×10°细胞/mL细胞悬液。 7.1.2吸取10mL细胞悬液于培养血中，在37℃土2℃含5%(V/V)CO2饱和水蒸气环境下孵育24h。 7.1.3吸出每一培养Ⅲ中的生长培养液，用Hank's液淋洗单层细胞后，加10mL新制备的琼脂培养 基。 7.1.4待琼脂培养基在室温下凝固（约30min）后，加人10mL中性红活体染色液并在暗处保存15~ 20min（有中性红时，培养基应避光保存，否则将损害细胞）。吸除多余的中性红溶液。 7.1.5在每一培养血中至少放置