ICS 11.060.10 YY C 33 中华人民共和国医疗行业标准 YY/T0127.10—2009 代替YY/T0127.10—2001 口腔医疗器械生物学评价 第2单元：试验方法 鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验 （Ames 试验） Biological evaluation of medical devices used in dentistry- Part 2: Test method-Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames mutagenicity test) 2009-06-16发布 2010-12-01实施 国家食品药品监督管理局 发布 YY/T0127.10—2009 前 言 物学评价第1单元：评价与试验》是口腔医疗器械生物学评价与试验项目的选择，为指南性标准。 YY/T0127《口腔材料生物学评价第2单元试验方法》分为以下几部分： YY/T0127.1-1993口腔材料生物试验方法溶血试验； 试验：静脉途径； -YY/T0127.3—1998 根管内应 用试验； YY/T0127.4—1998 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 骨埋植 试验； -YY/T0127.5—1999 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 吸入毒性 试验； -YY/T0127.6—1998 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 显性致死 试验； YY/T0127.72001 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 牙髓牙本 质应用试验； YY/T0127.8—2001 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 ，皮下植入 试验； -YY/T0127.92001 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 细胞毒性 试验（琼脂覆盖法及分子滤过法）； -YY/T0127.10一2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌 回复突变试验（Ames试验）； YY/T0127.11一2001牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第2单元：口 腔材料生物试验方法盖髓试验； YY/T0127.12—2008 3牙科学口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法微核 试验； YY/T0127.13—2009 口腔医疗器械生物学评价 第2单元：试验方法 口腔黏膜刺激 试验； —YY/T0127.14—2009 口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性经口全身毒性 试验； YY/T0244一1996口腔材料生物试验方法短期全身毒性试验：经口途径。 本部分为YY/T0127的第10部分。 本部分代替YY/T0127.10一2001《口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法鼠 伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）》。 本部分与YY/T0127.10—2001相比，主要变化如下： 一标准名称改为：《口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突 变试验（Ames试验）》； 规范性引用文件做了相应修改； 1 YY/T0127.10—2009 浸提液剂量由200mg/mL改为最高剂量； 受试样品由五个剂量改为至少三个剂量。分为最高剂量组、1/2最高剂量组和1/4最高剂 量组； 增加对固化类材料样品制备要求：“对于固化类材料，考虑固化状态材料的诱变性时，建议采用 固化24h士2h的试样进行试验。即试样固化后放于室温下，密封保存24h士2h。也可根据 其使用特点选择何时进行试验，但在报告中应予以注明”； 由于多氯联苯在国内、国外已经不再使用，因此将“多氯联苯”改为“苯巴比妥与3-甲基胆葱或 与β-苯丙黄酮”作为诱导剂。 本部分的附录A为规范性附录。 本部分由国家食品药品监督管理局提出。 本部分由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。 本部分主要起草人：林红、李盛林、付嘉、王衣祥、郝鹏。 本部分于2001年首次发布。于2009年第一次修订。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： YY0127.10—2001。 I YY/T0127.10—2009 口腔医疗器械生物学评价 第2单元：试验方法 鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验 （Ames试验） 1范围 YY/T0127的本部分规定了口腔医疗器械鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验方法。 本试验用于测定可引起沙门氏杆菌基因置换和/或移码突变的口腔材料所诱发的依赖于组氨酸 (his一)的菌株产生不依赖于组氨酸(his十）)的基因突变。为检测口腔医疗器械的诱变性试验之一。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过YY/T0127的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 GB7919—1987化妆品安全性评价程序和方法 GB15193.4一2003鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验 GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12- 2005,ISO10993.12:2002,IDT) 3仪器 3.1实验室常用设备。 3.2洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，低温高速离心机，低温冰箱（一80℃)或液氮罐等。 4培养基和试剂的制备 培养基和试剂的制备见附录A。 5菌株准备、鉴定和贮藏 5.1菌株 采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌共四株——TA97、TA98、TA100、TA102。 5.2菌株贮存 菌株贮存在加有二甲基亚砜的（光谱纯)新鲜细菌培养液中，其体积比为0.09：1，混合后分装于小 贮存。 5.3增菌培养 从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5mL营养肉汤培养基中，经37℃振荡（100次/min）培养10h～ 12h，活菌数应达10°/mL(OD600～0.4）。细菌培养液从37℃取出后，应立即放人4℃中备用。试验需 用当天孵育好的新鲜细菌。 1 YY/T0127.10—2009 5.4菌株鉴定 5.4.1组氨酸需求(his-）)试验 能生长。 鉴定方法：在底层培养基平血表面加入0.5mmol/LL-组氨酸0.1mL和0.5mmol/LD-生物素 0.1mL。用L棒铺开。对照平血只加生物素不加组氨酸。用白金耳浸细菌培养液，在对照平血和含有 组氨酸/生物素的平血表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平血皿上，经37℃孵育24h后，观察 细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平血上生长，在对照平血上不应生长。 5.4.2脂多糖屏障缺陷鉴定(rfa突变） 粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进入 菌体内而抑制其生长。野生型菌株或含gal缺失的菌株则不受影响。 鉴定方法：分别将每种细菌培养液0.1mL加到45℃2mL顶层培养基试管内，混匀后倾倒于营养 琼脂培养基平血表面，使其均匀分布。待固化后，取直径为6mm无菌滤纸圆片浸1mg/mL结晶紫溶 液10μL，放到平血中央。经37℃孵育24h后，围绕圆纸片出现透明的抑菌环（直径大约14mm），说明 此菌存在深粗型（rfa)突变。TA97、TA98、TA100、TA102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。 5.4.3对紫外线敏感性鉴定（uvrB修复缺陷型的鉴定） 具有uvrB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此证明uvrB突变的存在。 鉴定方法：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平血表面平行划线，四株细菌可划在同一平 血上。用黑纸覆盖平皿一半，在距离33cm处用15W紫外线杀菌灯照射平血8s，经37℃孵育24h后 观察结果。对紫外线敏感的菌株（TA97、TA98、TA100）只在未照射过的一半平血上生长。而具有 5.4.4抗氨芙青霉素（PKM101)试验（菌株R因子丢失鉴定） 含R因子的试验菌株对氨苄青霉素具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因 子的特性，故需鉴定R因子是否存在。 鉴定方法1用白金耳浸细菌培养液，在含氨苄青霉素平血表面平行划线，四株细菌可划在同一平 皿上。还应选用一个无抗性因子的菌株，以测定氨苄青霉素的效应。经37℃孵育24h后，无抗性因子 菌株不应生长。 鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平血表面平行划线，四株细菌可划在同一 平血上。将沾有氨苄青霉素溶液的滤纸条与划线交叉放置，37℃孵育24h。如滤纸条周围细菌生长正 常，说明试验菌株具有R因子。 5.4.5四环素(PAQI)抗性的鉴定 鉴定方法1：用白金耳浸细菌培养液，在含氨苄青霉素/四环素平血表面平行划线，四株细菌可划在 同一平血上。经37℃孵育24h后，对四环素有抗性的TA102菌株能生长，对四环素无抗性的菌株不 生长。 鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一 平皿上。待干后，吸取四环素（8mg/mL)溶液与菌株划线处交叉划线，37℃孵育24h。对四环素有抗 性的TA102菌株能生长，其他菌株不生长。 5.4.6自发回变数（his+）的测定 在小试管中加人融化的顶层培养基2mL，分别加入待测菌株的菌液0.1mL，迅速在高速液体混合 器上混匀，倾倒在已固化的底层培养基平皿上，使其均匀分布。待固化后，经37℃孵育48h，计数全部 菌落数。一个菌株应做2～3个平皿，以便计算平均菌落数。必要时可重复试验，以保证回变菌落数值 在一个恒定的范围。各试验菌株的自发回变数分别为：TA97（97～