行业文档 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1059.5—2006 食品和动物饲料大肠杆菌0157的检测方法 免疫磁珠法 Inspection method for the detection Escherichia coli O157 from food and animalfeeding stuffsImmunomagnetic separation (IS016654:200l,Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs HorizontalmethodforthedetectionofEscherichiacoliOl57,IDT) 2006-08-28发布 2007-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1059.5—2006 前 言 本部分为SN/T1059的第5部分。 本部分等同采用ISO16654：2001（E)《食品和动物饲料微生物学 大肠杆菌O157的检测方法》 （英文版）。 为便于使用，本部分做了下列编辑性修改： a）“本国际标准’一词改为“本部分”； b）用小数点“."代替作为小数点的逗号‘，"； c） 删除国际标准的前言； d）为了更符合中文习惯，本部分的名称稍做修改。 本部分附录A为资料性附录。 本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：苗丽、李志培、张巨洲、李苛、江志毅、杨向莹、乔晴。 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T1059.5—2006 食品和动物饲料大肠杆菌0157的检测方法 免疫磁珠法 警告：大肠杆菌0157是一种可以引起严重的危及生命的疾病，并且很低的剂量就可以引起感染的 致病菌。曾经有实验室获得感染的报道。 整个方法只能由那些采用良好实验室规范（GLP）、具有丰富经验的人员去实施，并且最好在一个可 控设施中进行，以保护实验室人员的安全。必须遵守有关的健康和安全的法规 传染性材料的处理必须谨慎。 1范围 SV/T1059的本部分规定了检测大肠杆菌O157的免疫磁珠法， 本部分适用于人类消费的食品或用作动物饲料的产品 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SV/T1059本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议 的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分 ISO6887-1食品和动物饲料微生物学一一实验样品制备、初始悬液和稀释液的微生物学检 测一一第1部分：制备初始悬液和稀释液的通用规则 ISO7218食品和动物饲料微生物学一一微生物学检测通用规则 3术语和定义 下列术语和定义适用于SN/T1059的本部分。 3. 1 大肠杆菌0157 E.coliO157 在本部分中使用的平板培养基表面上形成典型菌落，产生吲哚并且与O157抗血清发生特异性凝 集反应的细菌。 注1：山梨醇阳性的E.coliO157菌株在CT-SMAC培养基中观察不到。 注2：已发现有一些吲哚阴性的变异株。 4原理 大肠杆菌O157的检测应有以下4个连续步骤（参见附录A）： a) 增菌：测试部分样品在41.5℃土1℃下，用含新生霉素的改良胰蛋白陈大豆肉汤（mTSB十V） 的样品均质液孵育6h，之后再培养12h～18h进行增菌。 b) 富集纯化：使用包被有E.coliO157抗体的免疫磁珠分离并富集细菌。 c)） 分离：将粘附有细菌的免疫磁珠转移到亚碲酸钾山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC)和其他E.coli O157选择性分离培养基上进行分离培养。 d）确认：对于CT-SMAC上的山梨醇反应阴性菌落和其他类型分离平板上的典型E.coliO157 菌落，通过是否产生吲哚以及是否与E.coliO157抗血清产生凝集反应进行确认。 注：对阳性分离株的病原性特征的进一步鉴定，可以送到有关参考实验室进行。 1 SN/T1059.5—2006 5培养基、试剂和抗血清 5.1增菌培养基［含新生霉素的改良胰蛋白陈大豆肉汤（mTSB+N)」 5.1.1改良胰蛋白陈大豆肉汤（mTSB） 5.1.1.1成分 胰酪蛋白陈 17.0 g 植物蛋白陈 3.0 g D-葡萄糖 2.5 g 3号胆盐 1.5 g 氯化钠 5.0 g 4.0 g 磷酸氢二钾 蒸馏水 1000 mL 5.1.1.2制备 将各成分或合成脱水培养基溶解于水中，如果需要则进行加热，必要时用pH计调整pH值，使灭 菌后25℃时pH值为7.4±0.2。 将培养基适量分装到合适容量的三角烧瓶或其他瓶子中。 用高压灭菌锅121℃灭菌15min。 5.1.2新生霉素溶液 5.1.2.1成分 0.45 g 新生霉素 蒸馏水 100 mL 5.1.2.2制备 将新生霉素溶解在水中并用滤膜过滤除菌。 使用当天制备 5.1.3完全培养基的制备 使用前加1mL或4mL新生霉素溶液到225mL或900mL已冷却的mTSB中。新生霉素的最终 浓度为每升mTSB中含新生霉素20mg。 5.2第一种选择性分离培养基[亚碲酸钾山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC)」 5.2.1基础培养基 5.2.1.1成分 17.0 g 胰酪蛋白陈 动物组织蛋白陈 3.0 g 山梨醇 10.0 g 3号胆盐 1.5 g 氯化钠 5.0 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.001 g 琼脂 9 g~18g 蒸馏水 1 000 mL 注：琼脂量根据凝胶硬度酌情添加。 5.2.1.2制备 将基础培养基的各成分或合成脱水基础培养基溶解到水中并煮沸使其充分溶解，必要时，调整pH 值使灭菌后25℃时pH值为7.1土0.2。 2 SN/T1059.5—2006 高压灭菌锅中121℃灭菌15min。 5.2.2亚碲酸钾溶液 5.2.2.1成分 细菌学用途的亚碲酸钾 0.25 g 蒸馏水 100 mL 5.2.2.2制备 将亚碲酸钾溶解在水中并通过滤膜过滤除菌。 该溶液可以在室温下储存1个月，但如果有百色沉淀物形成时就丢弃不用。 5.2.3头孢克溶液 5.2.3.1成分 头孢克 5.0 mg 蒸馏水 100.0ml 5.2.3.2制备 将头孢克溶解到水中并通过滤膜过滤除菌。 注：头孢克可能需要在乙醇中溶解。 该溶液可以在3℃土2℃环境中贮存1周。 5.2.4完全培养基 5.2.4.1成分 1 000 mL 基础培养基（5.2.1) 亚碲酸钾溶液（5.2.2） 1.0 mL 头抱克溶液（5.2.3） 1.0 mL 5.2.4.2制备 将灭菌好的基础培养基（5.2.1)冷却至44℃～47℃（6.5)或将以前灭过菌但已经凝固了的基础培 养基通过热蒸汽使其融化后再冷却至44℃～47℃。 每1000mL基础培养基中加1mL亚碲酸钾溶液和1mL头孢克溶液，混合均勾，每个灭菌平皿 (6.15)中倾注约15mL，使其凝固。 最终亚碲酸钾浓度为2.5mg/L，头孢克浓度为0.05mg/L。 使用前干燥琼脂平板，最好是移开盖子，让琼脂面朝下，置于温度在25℃～50℃的烘箱（6.2）中，直 到培养基表面的水滴消失，此时就不需再继续干燥。琼脂平板也可以半开盖子放在层流安全柜中 30min，或盖上盖子过夜使其干燥 如果预先已制备，未干燥的琼脂平板可以放在黑塑料袋中或其他能保持湿度的容器中，在3℃土 2℃冰箱中可以贮存2周。 5.3其他类型选择性分离培养基 E.coliO157。 使用前立即干燥琼脂平板，最好是移开盖子，让琼脂面朝下，置于温度在25℃～50℃的烘箱（6.2） 中，直到培养基表面的水滴消失，此时就不需再继续干燥，琼脂平板也可以半开盖子放在层流安全柜中 30min，或盖上盖子过夜使其干燥 5.4营养琼脂 5.4.1成分 3.0 g 牛肉浸膏 蛋白陈 5.0 g 琼脂 9g~18g 3 SN/T1059.5—2006 蒸馏水 1000mL 注：琼脂量根据凝胶硬度酌情添加。 5.4.2制备 将各成分或脱水合成培养基溶解到水中，如果需要的话进行加热，必要时调整pH值，使其灭菌后 25℃时pH值为7.0±0.2。 将培养基适量分装到合适容量的三角烧瓶或其他瓶子（6.7）中。 高压灭菌锅中121℃灭菌15min。 5.4.3制备营养琼脂平板 每个平皿中倾注约15mL熔化后又冷却至44℃～47℃的培养基，并使其凝固。 使用前干燥琼脂平板，最好是移开盖子，让琼脂表面朝下，置于温度在25℃～50℃的烘箱（6.2）中， 直到培养基表面的水滴消失，此时就不需再继续干燥，琼脂平板也可以半开盖子放在层流安全柜中 30min，或盖上盖子过夜使其干燥 5.5胰蛋白陈/色氨酸培养基 5.5.1成分 胰蛋白陈 10.0 g 氯化钠 5.0 g DL-色氨酸 1.0 g 蒸馏水 1000 mL 5.5.2制备 将各成分溶解到水中，必要时进行加热煮沸，调整pH值使灭菌后25℃时pH值为7.5土0.2。 分装到合适容量的试管或瓶子中，每管5mL。 高压灭菌锅（6.1）中121℃灭菌15min。 5.6Kovac's吲哚试剂 5.6.1成分 对-二甲氨基苯甲醛 5.0 g 戊醇 75.0 mL 盐酸（pz为1.18g/mL~1.19g/mL） 25.0mL 5.6.2制备 将对-二甲氨基苯甲醛溶解到戊醇中，必要时水浴加热，水浴温度保持在44℃～47℃，冷却至室温 后加人盐酸，用棕色的玻璃瓶避光保存于3℃士2℃的温度环境中，试剂将变为黄色或浅棕色，并且无沉 淀物析出。 5.7抗大肠杆菌0157免疫