ICS 11.060.10 C33 YY 中华人民共和国医药行业标准 YY/T0127.9—2009 代替YY/T0127.9-2001 口腔医疗器械生物学评价 第2单元：试验方法 细胞毒性试验： 琼脂扩散法及滤膜扩散法 Biological evaluation of medical devices used in dentistry Part2:Test method Cytotoxicity tests:Agar diffusion test and filter diffusion test 2009-12-30发布 2011-06-01实施 国家食品药品监督管理局 发布 YY/T0127.9-—2009 前言 本标准是口腔医疗器械生物学评价系列标准中的一项标准。 口腔医疗器械生物学评价系列标准中的第一单元，YY/T0268：2008《牙科学口腔医疗器械生物 学评价第1单元：评价与试验》是口腔医疗器械生物学评价与试验项目的选择，为指南性标准。 该系列标准的第二单元是口腔医疗器械具体生物试验方法。共分为如下几部分： 1.YY/T0127.1-93口腔材料生物试验方法溶血试验 2.YY/T0127.2一2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性全身毒性试验： 静脉途径 3.YY/T0127.3-1998 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法根管内应用 试验 4.YY/T0127.4-2009 口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法骨埋植试验 5.YY/T0127.5—1999 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 吸人毒性 试验 6.YY/T0127.6-1998 口腔材料生物学评价 第2单元：口腔材料生物试验方法 显性致死 试验 7.YY/T0127.7-2001 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法 牙髓随牙本质 应用试验 8.YY/T0127.8-2001 口腔材料生物学评价 第2单元：口腔材料生物试验方法 皮下植人 试验 9.YY/T0127.9-2009 口腔医疗器械生物学评价 个第2单元：试验方法细胞毒性试验：琼脂扩 散法及滤膜扩散法 10.YY/T0127.10—2009 口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法 去鼠伤寒沙门氏杆菌 回复突变试验（Ames试验） 11.YY/T0127.11一2001牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第2单元：口 腔材料生物试验方法盖髓试验 12.YY/T0127.12一2008牙科学口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法微核试验 13.YY/T0127.13一2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法口腔黏膜刺激试验 14.YY/T0244-1996口腔材料生物试验方法短期全身毒性试验：经口途径 15.YY/T0127.14一2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性经口全身毒性 试验 16.YY/T0127.15一2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法亚急性和亚慢性全 身毒性试验：经口途径 本标准为YY/T0127系列标准的第9部分。 本标准是对YY/T0217.9一2001《口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法细 胞毒性试验：琼脂覆盖法及分子滤过法》的修订。 本版标准的技术内容基本等同采用ISO7405：2008《牙科学一牙科医疗器械生物学评价》中的第 6.2条琼脂扩散试验和第6.3条滤膜扩散试验。 1 YY/T0127.9—2009 本标准根据ISO7405：2008重新起草。个别地方进行了少量编辑性修改，使之更具可操作性。修 改之处在标准正文的右侧以竖线标出。并增加了资料性附录A和附录B，以便于与ISO7405：2008 比较。 本标准与YY/T0217.9一2001相比，主要变化如下： 标准名称改为：“口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及 滤膜扩散法”。 标准编辑格式进行了改变。 一琼脂扩散法中细胞反应的描述做了改变。褪色指数和溶解指数分别分级评价。 在滤膜扩散试验中取消了一种琥珀酸脱氢酶染色液配制方法。 本标准从实施之日起，同时废除并代替YY/T0217.9一2001《口腔材料生物学评价 第2单元：口 腔材料生物试验方法细胞毒性试验：琼脂覆盖法及分子滤过法》。 本标准由国家食品药品监督管理局提出。 本标准由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会（SAC/TC99)归口。 本标准由国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心负责起草。 本标准主要起草人：林红、郝鹏、李盛林、张研。 本标准于2001年首次发布。于2008年第一次修订。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -YY/T0127.9-2001 Ⅱ YY/T0127.9—2009 口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法 细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法 1范围 本标准规定了口腔医疗器械的细胞毒性试验方法：琼脂扩散法及滤膜扩散法。 本标准用于检测口腔医疗器械在通过琼脂或琼脂糖扩散后或通过醋酸纤维素滤膜扩散后的非特异 性细胞毒性。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5一2003，ISO 10993-5:1999,IDT) GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12 2005,ISO10993-12:2002,IDT) YY/T0268一2008牙科学口腔医疗器械生物学评价第1单元：评价与试验 3琼脂扩散法 3.1目的 本试验用于检测口腔医疗器械在通过琼脂或琼脂糖扩散后的非特异性细胞毒性。本试验不适用于 不能通过琼脂或琼脂糖扩散的可沥滤物。 3.2细胞系 选用已建立细胞系的成纤维细胞系或上皮细胞系[如来源自美国典型菌种保藏中心（ATCC)的细 胞系，ATCCCCL1(NCTCclone929)（小鼠成纤维细胞）或ATCCCCL2（Hela)（人上皮细胞系）等]。 应在记录中注明细胞系的编码。如适用，还应在记录中注明对选用的细胞系的描述和定义，以及选用合 理性的论证。 3.3培养基，试剂和设备 选用符合选定细胞系生长要求的培养基，过滤法灭菌。配制双倍浓度的细胞培养基（2），过滤法 灭菌。配制3%琼脂或琼脂糖，高压蒸汽灭菌。 临用前制备活体染色液，将1%水溶性中性红存贮液以1:100的比例用0.0lmol/L磷酸盐缓冲溶 液[如Dulbecco's磷酸盐缓冲液］稀释。中性红溶液应避光保存。选用直径90mm～100mm的培养皿 进行细胞培养。 3.4试样制备 试样制备见YY/T0268一2008第6条。根据GB/T16886.5的规定，可选用材料浸提液和/或材 料本身进行试验。 1 YY/T0127.9—2009 固体材料：制成直径约5mm的圆形试样。一面光滑以保证与覆盖的琼脂紧密接触。 a) b) 固化类的材料：将刚调和的材料填人内径5mm，高2mm的环形模具中。在记录中注明模具的 材质。当测试新鲜调和状态的材料时，应在填人材料之前将环形模具置于琼脂层上。如测试 不同固化时间的材料时，应使材料充填至与环形模具边缘平齐，并在温度37C士2°C，相对湿 度90%士10%的环境下固化直至试验开始。 液体材料或材料浸提液：吸取0.01mL液体于直径为5mm的圆形超细硼硅玻璃纤维滤纸或 其他载体上，置于琼脂上。 注1：合适的情性模具材料可以是玻璃或聚四氟乙烯（PTFE)。 注2：适用的滤纸可从预滤器制备。 3.5对照样本 使用阳性对照，阴性对照和参照材料（见GB/T16886.12）。 3.6试验步骤 培养细胞直至达到其对数生长期末。用生长培养基配制成2.5×10°细胞/mL细胞悬液，吸取适量 细胞悬液于足够数量的培养血中，每个培养血加人10mL细胞悬液。在37℃士2℃含5%（体积分数） CO2饱和水蒸气环境下孵育24h。如使用了不同的培养条件，应进行论证。 将已灭菌的琼脂或琼脂糖在水浴中加热至100℃，然后冷却至48℃。将1份琼脂或琼脂糖与1份新 配制的预热至48℃的2X生长培养基混合，使琼脂培养基的最终浓度为1X生长培养基。吸出每一培养 皿中的生长培养基，加10mL新制备的保持在48℃的琼脂或琼脂糖培养基。 待琼脂或琼脂糖培养基在室温下凝固（约30min）后，加入10mL中性红活体染色液并在暗处保存 15min～20min(有中性红时，培养基应避光保存，否则将损害细胞）。吸除多余的中性红溶液。 若适用，每个培养皿中放置适量的试样和对照材料。每个样本间尽量保持合适的距离（>20mm）。 将培养血于37℃土2℃含5%（体积分数)CO，的饱和水蒸气环境下孵育24h。每一试验材料至少应检 查四个平行样（即：每一试验材料至少检查两个培养皿）。通常在每一培养血中至少放置两个试样。若 使用了浸提介质，还应放一个浸提介质对照。每个样本尽量彼此远离，并远离培养血壁。 3.7评价指标 用有显微标尺的倒置显微镜观察试验材料和对照材料的周围褪色区域，并按表1和表2指标计算 每一试样的褪色指数和溶解指数。 表1褪色指数 褪色指数 描述 0 试样周围和试样下方未发现褪色 1 只在试样下方有褪色 2 褪色区边缘距试样边缘小于0.5cm 3 褪色区边缘距