ICS 13. 060.70,13.060.25 HG G 77 备案号：37849—2013 中华人民共和国化工行业标准 HG/T 4323—2012 循环冷却水中军团菌的检测与计数 Detection and enumeration of legionella in circulating cooling water 2012-11-07发布 2013-03-01实施 中华人民共和国工业和信息化部发布 HG/T 4323—2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准使用重新起草法参考ISO11731：1998《水质军团菌的检测和计数》（英文）和ISO11731- 2：2004《水质军团菌的检测和计数-2低菌数的直接膜过滤法》（英文）编制，与ISO11731：1998、 ISO11731-2：2004的一致性程度为非等效。 本标准的附录A和附录B为规范性附录。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出。 本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会（SAC/TC63/SC5)归口。 本标准起草单位：石家庄开发区德赛化工有限公司、上海轻工业研究所有限公司、石家庄市疾病预 防控制中心、中海油天津化工研究设计院、中国石油化工股份有限公司北京北化院燕山分院。 本标准主要起草人：李勇广、李静、李云、张全、郦和生、李丽婕、芦云红、郭玉梅、叶素妹。 HG/T 4323-2012 循环冷却水中军团菌的检测与计数 1范围 本标准规定了循环冷却水中军团菌的检测与计数方法。 本标准适用于循环冷却水中军团菌的检测与计数，也适用于原水、生活用水及其他工业用水的军团 菌的检测与计数。循环冷却水系统中沉积物和生物黏泥等相关样本中军团菌的检测也可参照本标准。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法（modISO3696：1987） GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T27405实验室质量控制规范食品微生物检测术语和定义 3术语与定义 GB/T27405界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 军团菌legionella 是一类菌种的总称，为革兰阴性杆形菌，两端钝圆，有鞭毛，无芽孢和荚膜，大小为（0.3～0.9）μm× （2～20）μm，有41个种属、61个血清型。其中嗜肺军团菌（Legionellapneumophia，Lp）有15个血清 型，是引起军团菌病的主要菌型。 4安全 本标准规定的检测应符合GB/T27403并应在二级隔离的生物实验室（BSL-2)完成，检出军团菌 的样品及培养基应经过无害化处理。 5方法提要 循环冷却水中军团菌数目一般达不到直接涂布检测的数目（105cfu/L），应通过膜过滤或离心方式 浓缩水样中的微生物。为了减少杂菌对军团菌生长的抑制作用，对浓缩的微生物进行酸处理或热处理。 将浓缩后的试样或滤膜转移到对军团菌具有选择性的GVPC培养基上培养，生长的菌落为疑似军团 菌。军团菌的典型特性是在活性炭-酵母提取液培养基（BCYE)生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE培 养基（BCYE-Cys)不生长。利用这一特性将疑似军团菌在BCYE和BCYE-Cys两种培养基上进行培 养，根据生长情况来确定是否为军团菌。另外，本标准中附录A给出了嗜肺军团菌的鉴定方法，在常规 鉴定。 6试剂和材料 6.1本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682三级水的 规定。 6.2活性炭-酵母提取液培养基(BCYE培养基）：按附录B中B.1制备。 1 HG/T4323—2012 6.3L-半胱氨酸缺失的BCYE培养基(BCYE-Cys培养基）：见附录B中B.2。 6.4选择性培养基(GVPC培养基）：按附录B中B.3制备。 6.5 酸缓冲液：按附录B中B.4制备。 6.6 Page'盐：按附录B中B.5制备。 6.7 氧化酶试剂：按附录B中B.6制备。 6.8硝酸盐培养基：按附录B中B.7制备。 6.9 尿素琼脂：按附录B中B.8制备。 6.10 营养明胶：按附录B中B.9制备。 6. 11 马尿酸水解试剂：按附录B中B.10制备。 6. 12 军团菌胶乳凝集试剂盒。 仪器、设备 7 7.1真空过滤系统。 7.2 微孔滤膜：直径为47mm~50mm，孔径为0.22μm~0.45μm。 7. 3 黑色硝化纤维膜：直径为47mm~50mm，孔径为0.22μm~0.45μm。 7. 4 接种环：D3mm。 7.5 超声波振荡器。 7. 6 涂布器。 7.7 无菌平皿：直径为90mm~100mm。 7.8 CO2培养箱：（36士1）℃。 7.9紫外线灯：波长为360nm士20nm。 7. 10 无菌镊子。 7. 11 低倍双目显微镜。 7. 12 微量可调移液器：100μL，300μL。 7. 13 离心机：转速为0～8000r/min，带有300mL～500mL具螺旋盖的离心瓶。 8水样采集 8.1用无菌玻璃、聚乙烯或类似容器收集水样100mL～1000mL，应详细记录样品的来源、体积和取 样时间。为了减少循环冷却水中杀菌剂对检测的影响，应在系统投加杀菌剂之前取水样。如果水样含 有氧化型杀菌剂，在采样前于无菌操作条件下，加人灭过菌的硫代硫酸钠，加人的量为每升水样 约0.1g。 注：循环冷却水系统中黏泥、沉淀物或沉积物可用较小的无菌容器收集，存放时宜配螺旋盖。 8.2水样采集后应立即送回实验室进行检测分析，运输时应避免光照。当天不能进行检测时，应在 2℃～8℃的冷藏条件下存储或运输，最好在2d内检测，最长不应超过14d。 9检测 9.1水样预处理 如果水样中军团菌的数量超过105cfu/L，可以直接涂布培养。当水样中军团菌的数量低于 105cfu/L时，应根据水样具体情况选用以下三种浓缩技术之-一进行处理：浓缩水样中的军团菌可通过 真空过滤、洗脱处理（9.1.1)；如果样品是浑浊的、乳浊的或有颜色的，应采用离心处理（9.1.2)；对于细 水样处理所使用器具使用前均应进行灭菌处理。 9.1.1水样的真空过滤、洗脱处理 2 HG/T4323-2012 在真空过滤系统上安装微孔滤膜，取200mL～1000mL水样过滤。过滤后取下滤膜，置于带盖的 无菌容器中，用无菌剪刀剪碎，加15mL无菌稀释液或无菌水，不断振荡至少2min充分洗脱（也可将容 器放入超声波振荡器中2min10min）。此即为制备好的试液。以下按9.2～9.7操作。 9.1.2水样的离心处理 于6000r/min下离心（10士1）min，或于30001/min下离心（30士1)min。移去上层清液。将沉淀用无 菌稀释液或无菌水稀释至2mL～20mL，记录稀释体积。此即为制备好的试液。以下按9.2～9.7 操作。 9. 1. 3 3水样的黑色硝化纤维膜过滤 在真空过滤系统上安装黑色硝化纤维膜，取5mL100mL水样过滤。为抑制杂菌的生长，样品过 滤后用酸缓冲溶液处理黑色硝化纤维膜，加人30mL酸缓冲液，静置5min后过滤去除酸缓冲液，再用 20mLPage'盐洗涤滤膜。以下按9.3~9.7操作。 9.2制样 9.2.1将经预处理制备好的试样(9.1.1或9.1.2)分成三份。其中一份不做处理，另两份分别采用热 处理和酸处理方式处理。 9.2.2热处理：移取0.5mL1.5mL试液(9.1.1或9.1.2)于一无菌容器中，将其置于(50±1）℃的 水浴中放置（30士2）min。 9.2.3酸处理：移取1.0mL～10mL试液（9.1.1或9.1.2)于一无菌容器中，加入与试液相同体积的 酸缓冲液，调pH值至2.2，轻轻摇匀，放置（5士0.5）min。 注：当试液浑浊时，将1.0mL10-mL的试样加人一个配有螺旋盖离心瓶中，离心分离。用无菌吸管将上层清液抽 出至原体积的一半，再用涡流或剧烈混合的方法使沉积物重新悬浮。加人酸缓冲液补充至原始体积，并轻轻地摇匀，放 置(5±0.5)min. 9.3接种 9.3.1采用真空过滤、洗脱处理或离心处理样品的接种 9.3.1.1用0.1mL未经处理试样(9.1.1或9.1.2)，接种于一GVPC琼脂培养基平血上。用一个无 菌涂布器将接种液均匀涂布于平的整个表面。记录接种试样的量（mL）。 9.3.1.2用0.1mL刚出水浴的热处理试样(9.2.2)，同上接种于第二个GVPC琼脂培养基平血上。 血上。 9.3.2采用黑色硝化纤维膜过滤样品的接种 用无菌镊子小心地将经9.1.3处理的黑色硝化纤维膜取下，将其平铺在GVPC培养基上（正面向 上），应确保培养基和膜片之间没有气泡。 9.4培养 将已接种的平板倒置放人含2.5%CO2的培养箱中，（36士1）℃培养2～10d。为确保培养箱内 保持一定湿度，宜在培养箱底部或顶部放一盘水。若无需计数，则可减少培养天数至检出军团菌止，但 不可少于2d。 9.5检查平板 在10d的培养期间，用显微镜在第三天和第四天观察两次，记录可疑军团菌菌落的数量。军团菌 的生长很可能被其他菌掩盖或抑制，如果怀疑军团菌被抑制应重新处理水样进行培养；在平板上生长小 于300个菌落为宜，如有强的生长背景时，应重新稀释样品或减少过滤的样品体积。典型的军团菌菌落 通常是白-灰-蓝-紫，也可能出现棕色、粉色、灰绿色、深红色。军团菌表面光滑、边缘整齐，呈典型的毛玻 璃状。在紫外光下有荧光，荧光的颜色有助于区分样品