ICS 65.020.01 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 4230—2025 牛羊产气荚膜梭菌病荧光定量 PCR诊断技术 Fluorescent quantitative PCR diagnostic techniques for Clostridium perfringens infections in cattle and sheep 2025-10-30发布 2025-11-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 4230 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制 中心、准格尔旗动物疫病预防控制中心、内蒙古兴安盟突泉县动物疫病预防控制中心、 内蒙古自治区质 量和标准化研究院。 本文件主要起草人： 韩四娥、徐丽媛、金鹰、史文瑞、张博、乔煜婷、关平原、李劼、赵丽霞、徐 晓静、郭宇、刘慧、周治国、王震、刘月 。 DB15/T 4230 —2025 1 牛、羊产气荚膜梭菌病荧光定量 PCR诊断技术 1 范围 本文件规定了牛、羊产气荚膜梭菌病的临床诊断、样品采集和保存、荧光定量 PCR定种和分型鉴定 方法。 本文件适用于牛、羊产气荚膜梭菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 3073 家畜魏氏梭菌病诊断技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 牛产气荚膜梭菌病 clostridium perfringens infections in cattle 由产气荚 膜梭菌引起牛的一种急性、致死性传染病。其特点是发病急、死亡快，多以出血性坏死性 肠炎和全身毒血症为主要特征。 羊产气荚膜梭菌病 clostridium perfringens infections in sheep 由产气荚膜梭菌引起羊的一种急性、致死性传染病。其特点是发病急、死亡快。死后解剖可见特征 性的出血性肠炎、 “肾软化”等病变。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CP：产气荚膜梭菌（ Clostridium Perfringens ） DEPC：焦碳酸二乙酯（ Diethyl Pyrocar bonate） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic Acid ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffered Saline ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） DB15/T 4230 —2025 2 qPCR：荧光定量 PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction ） 5 临床诊断 按照NY/T 3073 相关规定执行 。 6 样品采集 和保存 按照GB 19489 和NY/T 541 相关规定执行。 7 荧光定量 PCR定种鉴定 仪器设备 7.1.1 二级生物安全柜。 7.1.2 台式低温高速离心机。 7.1.3 组织研磨仪或研钵。 7.1.4 全自动核酸提取仪。 7.1.5 荧光定量 PCR仪。 7.1.6 旋涡混匀器。 7.1.7 微量可调移液器 （1 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL ）。 试剂材料 7.2.1 无酶无菌带滤芯吸头。 7.2.2 PCR扩增管。 7.2.3 商品化PCR预混液。 7.2.4 商品化细菌 DNA提取试剂盒。 7.2.5 阴性对照： DEPC水。 7.2.6 阳性对照： 带目的片段的质粒 DNA，制备方法与基因序列见 附录A中的A.1、A.2。 7.2.7 引物和探针见附录 A中A.3，加DEPC水配制成 100 μmol/L的储存浓度和 10 μmol/L工作浓度。 试验方法 7.3.1 样品处理 7.3.1.1 肛拭子样品 在1 mL PBS中反复挤压 肛拭子样品 ，使用旋涡混匀器充分涡旋振荡后， 备用。 7.3.1.2 粪便、肠道内容物及其他 组织样品 无菌取粪便或肠道内容物 约1 g，加入5 mL PBS ，混合均匀，备用；或 剪取典型病变组织约 1 g，加 入5 mL PBS ，于组织研磨仪 或研钵中充分研磨成悬液，备用。 7.3.2 样品DNA提取 DB15/T 4230 —2025 3 采用细菌 DNA提取试剂盒或用 全自动核酸提取仪，提取各类样品（ 肛拭子、粪便、肠道内容物及其 他组织样品 等）中的细菌 DNA。 7.3.3 反应体系配制 产气荚膜梭菌 qPCR定种鉴定反应总体系为 25 µL，使用附录 A中A.3的产气荚膜梭菌定种 引物及探针， 按照表1配制qPCR定种鉴定 反应体系，瞬时离心后，放入 荧光定量 PCR仪中进行反应，同时设阴性对照和 阳性对照。 表1 qPCR定种鉴定 反应体系 组分 体积/μL 2×Hieff Unicon ® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5 CP-上游引物 （10 μmol/L ） 0.75 CP-下游引物 （10 μmol/L ） 0.75 CP-荧光探针 （10 μmol/L ） 0.5 模板DNA 5 加DEPC水至 25 7.3.4 反应程序 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s（收集荧光） ，共45个循环。 结果判定 7.4.1 试验成立条件 阴性对照无 Ct值或Ct值＞40且未出现特异性扩增曲线，阳性对照 Ct值≤35且出现特异性扩增 曲线，判为试验成立。否则，本次试验无效。 7.4.2 判定标准 被检样品 Ct值≤35且出现特异性扩增曲线， 判定为 CP核酸阳性； 被检样品无 Ct值或Ct值＞40， 判定为CP核酸阴性；被检样品 35＜Ct值≤40且出现特异性扩增曲线，判定为 CP核酸可疑，需复检。 如复检结果为阳性或可疑，则判定为 CP核酸阳性，否则判定为阴性。 8 多重荧光定量 PCR分型鉴定 仪器设备 见7.1。 试剂材料 8.2.1 无酶无菌带滤芯吸头。 8.2.2 PCR扩增管。 8.2.3 商品化PCR预混液。 8.2.4 商品化细菌 DNA提取试剂盒。 8.2.5 阴性对照： DEPC水。 8.2.6 阳性对照： A～G型CP阳性对照分别为带目的片段的重组质粒，制备方法与基因序列见附录 BDB15/T 4230 —2025 4 中的B.1、B.2。 8.2.7 引物和探针见 B.3，加DEPC水配制成 100 μmol/L 的储存浓度和 10 μmol/L 工作浓度。 试验方法 8.3.1 样品处理 肛拭子样品 与粪便、肠道内容物及其他组织样品处理分别按照 7.3.1.1与7.3.1.2。 8.3.2 样品DNA提取 按照7.3.2方法。 8.3.3 反应体系配制 使用附录 B中B.3的毒素基因分型引物 及探针，按照表2（含α、β、ε毒素引物与探针 ）和表3 （含ι、cpe、NetB毒素引物与探针 ）分别配制多重荧光定量分型鉴定反应体系 1与反应体系 2。瞬时 离心后，放入 荧光定量 PCR仪中进行反应 ，同时设阴性对照和阳性对照 （分别加 α、β、ε毒素的阳 性对照与 加ι、cpe、NetB毒素的阳性对照） 。 表2 多重荧光定量分型鉴定反应体系 1 组分 体积/μL 2×Hieff Unicon ® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5 α毒素-F（10 μmol/L ） 1.0 α毒素-R（10 μmol/L ） 1.0 α毒素-P（10 μmol/L ） 0.5 β毒素-F（10 μmol/L ） 1.0 β毒素-R（10 μmol/L ） 1.0 β毒素-P（10 μmol/L ） 0.5 ε毒素-F（10 μmol/L ） 1.0 ε毒素-R（10 μmol/L ） 1.0 ε毒素-P（10 μmol/L ） 0.5 模板DNA 5 总体积 25