ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2810—2015 橡胶树褐根病菌鉴定方法 Methods for identification of Phellinus noxius(Corner )G.H.Cunn of rubber tree 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2810—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部农垦局提出， 本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所、厦门出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：贺春萍、梁艳琼、林石明、李锐、吴伟怀、郑肖兰、郑金龙。 I 学兔兔Wxuetutu.con NY/T2810——2015 橡胶树褐根病菌鉴定方法 1范围 本标准规定了橡胶树褐根病菌（Phellinusnorius）的术语和定义、鉴定依据、试剂及配制方法、采 样、症状鉴定、培养鉴定、PCR鉴定、结果判定、标本和样品保存等技术要求。 本标准适用于橡胶树褐根病菌（P.notius)的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T28095，木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 橡胶树褐根病 brown rootdisease of rubbertree 由有害层孔菌[Phellinusnorius(Corner)G，H.Cunn]引起的一种为害橡胶树根部的真菌病害。该 病害病原菌的危害症状和培养性状见附录A。 4鉴定依据 依据褐根病菌在橡胶树上的为害症状、形态特征、室内病原菌培养性状以及PCR特异性反应进行 鉴定。根据褐根病菌核糖体基因内转录间隔区（rDNA-ITS)特有碱基序列设计特异性引物进行PCR 扩增。依据是否扩增获得预期653bp的特异DNA片段，判断样品中是否携带橡胶树褐根病病菌。 5试剂及配制方法 5.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 称取200g洗净去皮的马铃薯，切碎，加一级超纯水900mL煮沸30min，纱布过滤，再加20g葡萄 糖（化学纯)充分溶解后，用→级超纯水定容至1000mL，分装后，每100mL培养基中加人2.2g琼脂粉 （高纯度），121℃高温灭菌20min，4℃或室温保存备用。马铃薯葡萄糖液体培养基不加琼脂粉。 5.2试剂 琼脂粉、葡萄糖、无菌水、75%酒精、氯化钠、0.1%升汞、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、氢氧化 钠(NaOH)、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、冰乙酸、四环素、链霉素、异丙醇、无水乙醇、真菌DNA提取试剂 盒、琼脂糖、液氮、蒸馏水、TaqDNA聚合酶、引物、DNA纯化试剂盒、PCR产物回收试剂盒、pMD18-T Vector、感受态细胞、Goldenview核酸染料、DL2000Marker、TAE电泳缓冲液等。 5.3试剂配制 5.3.1四环素（Tetracycline) 称取0.1g四环素溶解于无水乙醇，定容至10mL。以50μg/mL终浓度添加于生长培养基。 5.3.2链霉素（Streptomycin） 称取0.5g链霉素硫酸盐溶解于足量的无水乙醇中，最后定容至10mL。以100ug/mL的终浓度 1 学兔兔wWxuetutu.con NY/T2810—2015 添加于生长培养基。 5.3. 31 mol/ L Tris -HCI(pH 8.0) 纯）调pH至8.0，加超纯水定容至1000mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 5.3.410mol/LNaOH 称取80.0g氢氧化钠（NaOH，分析纯)溶解于160mL一级超纯水中，溶解后再加一级超纯水定容 到200mL。 5.3.51 mol/ L EDTA - Na2 (pH 8. 0) 称取372.2g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2，优级纯），溶解于70mL一级超纯水中，再加人适量 定容至100mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 5.3.6TE缓冲液(pH8.0) 分别量取10mLTris-HCI(5.3.4)和1mLEDTA-Na2（5.3.5），加一级超纯水定容至1000mL。 分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。 5.3.750×TAE电泳缓冲液（pH8.0) 100mLEDTA-Na2（5.3.5），用冰乙酸（分析纯）调pH至8.0，然后加一级超纯水定容到1000mL。室 温保存备用，使用时用一级超纯水稀释成1XTAE。 5.3.8PCR反应试剂 10×PCR缓冲液（Mg2+Plus）、dNTP（2.5mmol/L）、Taq聚合酶（5U/μL）及特异性引物对（10 μmol/ L)。 6采样 仔细检查橡胶树根和根茎部，发现橡胶树褐根病疑似症状（见A.1），将可疑部分切（锯）下500g以 上，装入封口袋中，备用。 7症状鉴定 根据发病植株的症状（见A.1)，观察记录发病植株有无类似橡胶树褐根病的网纹状菌丝束、菌膜以 及子实体。 8培养鉴定 洗净根部泥沙土，在无菌操作台上剪取长宽为0.5cm大小的病块组织，用75%酒精十0.1%升汞的 溶液进行表面消毒30s～60S，无菌水清洗3次，灭菌滤纸吸干水分，移植到PDA培养基上，28℃恒温培 养5d10d，出现真菌菌落，立即挑取菌落边缘菌丝进行转皿，观察菌落的形态、颜色等形态特征（见 A.2)。 9PCR鉴定 9.1病菌DNA提取及检测 9.1.1菌丝体收集及DNA提取 将待检分离菌株和阴性对照菌株的菌丝体分别接种至含50μg/mL四环素、100μg/mL链霉素的 马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃150r/min振荡培养5d，用滤纸过滤收集菌丝体，将收集的菌丝体分 摊在无菌离心管管壁，于一70℃冰箱冷冻12h。将冷冻好的菌丝体于真空冷冻干燥机抽真空至菌丝体 2 学兔兔WW xuetutu.con NY/T2810—2015 完全干燥，然后将菌丝体放置于研钵中加人液氮迅速研磨成粉末，按DNA提取试剂盒步骤提取DNA。 9.1.2病组织DNA提取 将病组织切成长宽约0.5cm小块，用液氮冷冻后研磨成粉，取0.2g粉末，按DNA提取试剂盒步 骤提取DNA。 9.2PCR扩增 PCR反应体系2.5μL10XPCR缓冲液（含Mg2+）,2μLdNTPs(10mmol/L)，引物对G-F(5'- GCCCTTTCCTCCGCTTATTG-3')/G-R(5'-CTTGATGCTGGTGGGTCTCT-3')各1μL（10 阴性对照。 PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延 伸5min，4℃保存。 9.3PCR产物凝胶电泳检测 9.3.1凝胶制备 用1×TAE工作液配制质量分数为1.0%琼脂糖凝胶，在微波炉中溶化混匀，冷却至60℃左右；加 入核酸染料，混匀，倒入胶槽，插上样品梳；待凝胶凝固后，拔出固定在凝胶中的样品梳，将带凝胶的胶板 置于电泳槽中，使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加人1XTAE电泳缓冲液（缓冲液越过凝胶表面 即可）。 9.3.2加样与电泳 取1μL加样缓冲液与5μLPCR反应产物，混匀，然后分别将其和DNA分子量标准加人到电泳槽 的负极样品孔中；接通电源，电泳电压为5V/cm，当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移到凝胶1/2位置，切断 电源，停止电泳。凝胶成像系统观察、拍照。 10结果判定 10.1若为害症状符合第7章或无性阶段培养特征符合第8章鉴定特征，可初步判定为橡胶树褐根病。 10.2若PCR特异性反应阳性，即PCR扩增获得653bp的DNA片段（见图B.1），可判定为橡胶树褐 根病菌。 11标本和样品保存 分离获得的橡胶树褐根病菌分离物转移至PDA培养基的试管内，放置于15℃条件下保存。病根 样品和菌株至少保存6个月。 12废弃物处理 生物材料、有毒有害废弃物要进行无害化处置。 3 学兔兔wW xuetutu.con NY/T2810—2015 附录A （规范性附录） 橡胶树褐根病菌的基本信息 A.1症状 A.1.1地上部症状 寄主植物全株生势衰弱，树冠叶片稀疏，顶芽抽不出或抽芽不均匀，叶片变小，无光泽，以至黄化、凋 萎，脱落，枝条干枯，最后整株枯死（见图A.1）。有的植株树干基部出现条沟、凹陷或烂洞，高温多雨季 节会在病死树头基部长出黑褐色菌膜和子实体 图A.1橡胶树褐根病菌为害橡胶树症状 A.1.2地下部症状 病根表面黏附泥沙多，凹凸不平，不易洗脱，茎基部及根部表面常有黄色、深褐色至黑褐色菌丝 面（菌丝或菌膜），根部菌丝面常与泥沙结合而不明显。病根散发出蘑菇气味。剖开茎基部及根部的 树皮，可见树皮内侧面和木质部组织干腐，质硬而脆，部面呈不规则黄褐色网纹，又称蜂窝状褐纹（见 图A.2)。 有的茎基部可观察到黄褐色至黑褐色的平伏至具菌盖的子实体，其比菌丝面坚硬且有细小的菌孔 （见图A.3）。子实体生于病死树头或树干上，单生，多年生，菌盖半圆形或平伏反卷，无柄。菌肉褐色， 单层，子实层体管孔状，菌管多层。将受感染的木材（病组织)放置在封口塑胶袋内，高湿保持2d～5d， 病组织表面可形成黄褐色菌丝面。 学兔兔wWxuetutu.con NY/T2810—2015 图A.2橡胶树褐根病病根症状 图A.3橡胶树褐根病子实体 A.2病原特征 A