ICS 65.020 LY B 60 中华人民共和国林业行业标准 LY/T2426—2015 枣品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 Technical regulations for the identification of Chinese jujube (Ziziphus jujubaMill)cultivars--SSR markermethod 2015-01-27发布 2015-05-01实施 国家林业局 发布 中华人民共和国林业 行业标准 枣品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 LY/T2426—2015 中国标准出版社出版发行 北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045) 网址www.spc.net.cn 总编室：(010)68533533 发行中心：(010)51780238 读者服务部：(010)68523946 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销 * 开本880×12301/16 印张1.25 5字数32千字 2015年4月第一版 2015年4月第一次印刷 * 书号：155066·228552 2定价21.00元 如有印装差错由本社发行中心调换 版权专有1 侵权必究 举报电话：(010)68510107 LY/T2426~2015 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家林业局提出并归口。 本标准起草单位：北京林业大学。 本标准主要起草人：庞晓明、李颖岳、续九如、王斯琪、麻丽颖、刘华波。 I LY/T2426—2015 枣品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）分子标记对枣（Ziziphusjujuba Mill)品种DNA指纹鉴定的试验方法。 本标准适用于基于SSR分子标记技术构建的DNA指纹图谱对枣品种DNA分子数据采集和品种 鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则 LY/T2190一2013植物品种特异性、一致性、稳定性测试指南枣 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 核心引物 coreprimer 人工合成的，多态性、稳定性、重复性等综合特性较好，用于品种DNA指纹鉴定必须选用的一套 SSR引物。 3.2 SSR指纹图谱SSRfingerprint 基于SSR分子标记鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管 电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。 3.3 参照品种 reference cultivar 多样性好，核心引物位点扩增片段大小已知的一组品种。参照品种用于比对待测样品在某个SSR 位点上等位变异扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。 3.4 待检样品testsample 送检单位提供的待鉴定的枣种质、品系、品种。 3.5 对照品种 controlcaltivar 与待检样品近似的品种，用于与待检样品进行对比；或指已知品种中与待检样品相似度最高的 品种。 1 LY/T2426—2015 4原理 性引物对重复序列进行聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR)扩增，扩增产物的片段长度可以 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色，或通过毛细管电泳技术加以区分。不同的枣品种间遗传 组成存在差异，某些SSR位点重复次数不同显示不同的谱带，从而实现品种差异鉴定。 5仪器设备及试剂 除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯。仪器设备及试剂参见附录A。 6溶液配制 所有用水按照GB/T6682的要求，相关溶液配制方法参见附录B。 7核心引物 核心引物相关信息见附录C，附录C中的参考品种及代码参见附录D。 8枣样品DNA指纹图谱鉴定及其使用 枣样品DNA指纹图谱鉴定报告书参见附录E。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品 种的编号及名称。同一名称不同来源的对照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来 源的参照品种时，应与原参照品种核对，确认无误后使用。对于附录D中未包括的等位变异，应按本标 准方法，确定其大小和对应参照品种。 9操作程序 9.1样品准备 试验样品为待鉴定枣样品和对照品种的叶片、枝条等器官或组织，最好为幼嫩叶片，采样后在4℃ 贮藏条件下送至检测机构。选用2个～3个参照品种同时进行分析。 9.2DNA提取 按以下步骤进行DNA提取： a）称取样品组织材料0.30g，放人一20℃预冷的研钵中，加人液氮迅速研磨至粉末状后，立即用 预冷的药匙转移至2mL离心管中，依次加人1mL预热（65℃）的DNA提取缓冲液和 50μLβ-巯基乙醇，充分颠倒混匀。 b）65℃恒温水浴50min，每隔10min轻轻颠倒混匀一次，12000g常温下离心10min。 取上清液，加入等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1，体积比），轻轻颠倒混匀，静置 c) 10min，于常温下12000g离心10min。 取上清液，转人另一个2mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1，体积比），轻轻颠倒 (P 混匀，静置10min，于4℃12000g离心10min。 2 LY/T2426—2015 吸取上清液于新的1.5mL离心管中，加人等体积一20℃预冷的异丙醇沉淀DNA，颠倒混勾， 在一20℃下静置30min；12000g，4℃离心10min，弃上清液。 f) 注：其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。 9.3PCR扩增 9.3.1SSR引物 使用的核心引物及其序列见附录C。 9.3.2PCR反应体系 利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，PCR反应体系为10μL，包括成分为：20ng～25ng基因组 DNA，TaqDNA聚合酶1.0U,1×PCR缓冲液，每种dNTPs0.2mmol/L，正向引物和反向引物各 0.2μmol/L，剩余体积用超纯水补足至10μL。 利用毛细管电泳检测时PCR反应体系为10μL，包括成分为：20ng～25ng基因组DNA，Taq 3.2μmol/L，正向引物0.8μmol/L，剩余体积用超纯水补足至10μL。 9.3.3PCR反应程序 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃~ 65℃（根据附录C引物退火温度设定）退火40s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸5min，4℃ 保存。 毛细管电泳检测时，PCR反应程序为：94℃预变性5min94℃变性30s，50℃～65℃（根据附 录C引物退火温度设定）退火40s，72℃延伸45s，共30个循环；94℃变性30s，53℃退火40s， 72℃延伸45s，8个循环；72℃延伸5min，4℃保存。 9.4PCR产物检测 9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE） 9.4.1.1清洗玻璃板 用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净并晾干。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。小玻璃板用1mL - 剥离硅烷处理，大玻璃板用3mL预混的亲和硅烷工作液处理。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。 9.4.1.2组装电泳板 将两块玻璃板晾干，以0.4mm的边条置于大玻璃板左右两侧，将小玻璃板压于其上并固定，用胶 带封住底部；在两玻璃板两侧在有边条处用夹子夹住，注意间距。 9.4.1.3配胶及灌胶 按附录B配制50mL6%的变性PAGE胶溶液，轻轻混匀后灌胶。灌胶过程中防止出现气泡。待 胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳平齐端向里轻轻插人胶液约0.5cm处。室温下聚合1h 以上。待胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗干净备用。 9.4.1.4预电泳 正极槽（下槽）中加人1×TBE缓冲液（没过下槽高度的80%），在负极槽（上槽）加入1×TBE缓