ICS 67.040 LS x 11 中华人民共和国粮食行业标准 LS/T 61302017 粮油检验 粮食中伏马毒素 B1 、B2 的测定 超高效液相色谱法 Inspection of grain and oils-Determination of fumonisins B, ,B2 in grains- Ultra-high performance liquid chromatography 2017-10-27发布 2017-12-20实施 国家粮食局 发布 LS/T 6130—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC270）归口。 本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、安徽国家粮食质量监测中心、黑龙江粮油卫生检验监测 站、湖南国家粮食质量监测中心、遂宁市粮食质量监督检验站、北京农业质量标准与检测技术研究中心。 本标准主要起草人：谢刚、黎睿、李丽、叶金、王松雪、吴宇、胡斌、徐春锋、许艳霞、李小明、李森、 陆安祥。 I LS/T6130—2017 粮油检验 粮食中伏马毒素B1、B2的测定 超高效液相色谱法 1范围 本标准规定了粮食及其制品中伏马毒素B1、B2超高效液相色谱法测定的原理、试剂与仪器设备、分 析步骤、结果计算等内容。 本标准适用于粮食及相关制品中伏马毒素B、B2的测定。 本标准方法伏马毒素Bl、Bz的检出限为0.05mg/kg，定量限为0.25mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T6682 2分析实验室用水规格和试验方法 3原理 用提取液提取试样中的伏马毒素B、B2，经免疫亲和柱净化、富集后，用邻苯二甲醛衍生，超高效液 相色谱荧光检测器测定，外标法定量。 4试剂和仪器设备 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。 4.1试剂 4.1.1 甲醇(CHOH)：色谱纯。 4.1.2 乙腈（CH.CN）：色谱纯。 4.1.3 四硼酸钠（NazB,O，·10H2O)：分析纯。 4.1.4 氯化钠(NaCI)：分析纯。 4.1.5 磷酸氢二钠（Na2HPO,）：分析纯。 4.1.6 磷酸二氢钾（KHzPO,）：分析纯。 4.1.7 氯化钾（KCI)：分析纯。 4.1.8 浓盐酸(HCI)：分析纯。 4.1.9 9乙酸（CH，COOH）：色谱纯。 4.1.10 邻苯二甲醛（OPA，CH。O2）：分析纯。 4.1.11 2-硫基乙醇(C2HOS)：分析纯。 4.1.12 0.1mol/L四硼酸钠溶液：称取3.8g四硼酸钠（4.1.3），用水溶解并定容至100mL。 1 LS/T6130—2017 4.1.132mol/L盐酸溶液：将1体积浓盐酸（4.1.8)溶解在5体积水中。 (4.1.6）、0.2g氯化钾（4.1.7)溶解于990mL水中，用2mol/L盐酸溶液（4.1.13)调节pH为7.0，最后定 容为1L。 4.1.161%乙酸水溶液：量取99体积水，加人1体积乙酸（4.1.9）。 4.1.17衍生溶液：取40mg邻苯二甲醛（4.1.10)加入1mL甲醇（4.1.1)溶解，加人0.1mol/L四硼酸钠 溶液（4.2.1)5mL稀释，加人2-硫基乙醇（4.1.11)80μL，混匀。过0.22μm滤膜后，存于具塞棕色瓶中， 在室温避光处可储藏1周。 4.1.182%乙酸化甲醇：量取98体积甲醇（4.1.1），加人2体积乙酸（4.1.9）。 其他试剂应符合GB/T602的要求。 4.2标准品 4.2.1伏马毒素B，和B2标准品：晶体，纯度95%；或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。 4.2.2伏马毒素标准储备液：使用伏马毒素标准物质溶液；或准确称取适量伏马毒素B和Bz标准品 （4.2.1），用乙腈水溶液（4.1.14)溶解，配成伏马毒素B、B²浓度均为100mg/L的标准储备液。一20℃ 避光保存。 4.2.3伏马毒素混合标准溶液：准确吸取适量伏马毒素B1、B2标准储备液（4.2.2），用乙腈水溶液 (4.1.14)定容，摇匀，配成伏马毒素Bi、Bz浓度均为10mg/L的混合标准溶液。 4.2.4伏马毒素标准工作液：分别取适量伏马毒素混合标准溶液（4.2.3），用乙腈水溶液（4.1.14）稀释， 配成伏马毒素B、Bz浓度均为0.1mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、5.00mg/L的 标准工作液。 4.3材料与仪器设备 4.3.1 快速定性滤纸：Φ12cmWhatman4号，或性能相当者。 4.3.2 滤膜：0.22μm，有机系。 4.3.33 玻璃微纤维滤纸：g9cmWhatmanGF/A，或性能相当者。 4.3.4 伏马毒素免疫亲和柱：对伏马毒素B，和Bz均有100%的交叉反应性。 4.3.5 注射器：20mL。 4.3.6·7 离心管：10mL、50mL。 4.3.7 三角瓶：250mL。 4.3.8 量筒：100mL、10mL。 4.3.9 天平：感量0.1g和0.01mg。 4.3.10 高速粉碎机。 4.3.11 空气压力泵。 4.3.12 氮气吹干仪。 4.3.13 高速均质器：转速6500r/min~24000r/min。 4.3.14 离心机：转速≥5000r/min。 4.3.15 调速多用振荡器（振荡频率≥150次）。 6泵流操作架。 4.3.16 4.3.17试验筛：1mm孔径。 4.3.18 样品瓶：2mL。 4.3.19 玻璃内衬管：250μL。 2 LS/T6130—2017 4.3.20液相色谱柱：C18柱（柱长50mm或100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或性能相 当者。 4.3.21超高效液相色谱仪：包括超高效液相色谱仪、超高压液相色谱仪和超高速液相色谱仪，配备荧 光检测器和数据处理系统。 色谱参考条件： 色谱柱：C18柱（柱长50mm或100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或性能相当者。 柱温：30℃。 流动相：A为1%乙酸水溶液（4.1.16），B为乙腈（4.1.2），等度洗脱，A：B=50：50。 流速：0.2mL/min。 进样量：2μL。 荧光检测波长：激发波长310nm、发射波长435nm。 5分析步骤 5.1扦样与分样 按GB/T5491执行，在采样过程中，注意防止样品污染。 5.2样品制备 5.2.1提取 样品用高速粉碎机（4.3.10）粉碎，过1mm孔径试验筛（4.3.11），混合均匀后，取有代表性样品不少 于500g，供检测用。称取25.0g（精确到0.1g）充分混匀的试样，置于均质杯或250mL三角瓶中，加人 100mL(V,）乙睛水溶液（4.1.14），高速均质提取2min，或者用调速多用振荡器（5.3.15）振荡提取 30min，用定性滤纸（4.3.1）过滤或转移25mL的提取液于50mL的离心管中，于5000r/min离心 5min。取1.5mL(V²）滤液或离心管中上层液体，加人35mL(V3)PBS缓冲液（4.1.15）稀释，混匀，于 7000r/min离心10min，离心液备用。 5.2.2净化 射器内，将空气压力泵（4.3.11）与注射器连接，调节压力使溶液以约1滴/s的流速缓慢通过免疫亲和 柱，直至空气进人亲和柱中，依次用10mLPBS缓冲液（4.1.15）、10mL水淋洗亲和柱，流速为1滴/s~ 2滴/s，弃掉全部流出液，抽干免疫亲和柱。免疫亲和柱中注入3mL酸化甲醇（4.1.18），流速以1滴/s 缓慢流出，收集全部洗脱液于10mL离心管中，在55℃下氮气吹干，准确加入0.5mL（V)乙睛水溶液 (4.2.3）溶解残留物，涡旋混合30s，过0.22μm滤膜（4.3.2），备用。 注：由于不同厂商提供的亲和柱操作程序可能有所不同，实际操作时，也可参照免疫亲和柱厂商提供的操作说明和 程序使用。 5.3衍生化反应 分别取上述净化液和标准工作液（4.2.4）各100μL，置于装有内衬管（4.1.19）的样品瓶中，加入 100μLOPA衍生液（4.1.17），混合均匀后，静置3min，作为待测液，应立即进样分析。 5.4标准曲线的制作 将衍生后伏马毒素标准系列溶液（4.2.4)由低到高浓度检测分析。以伏马毒素浓度为横坐标，相对 3