ICS 67.040 LS x 11 中华人民共和国粮食行业标准 LS/T6129—2017 粮油检验 粮食中玉米赤霉烯酮的测定 超高效液相色谱法 Inspection of grain and oils--Determination of zearalenone in grains- Ultra-high performance liquid chromatography 2017-10-27 发布 2017-12-20实施 国家粮食局 发布 LS/T6129—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC270)归口。 本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、安徽国家粮食质量监测中心、湖南国家粮食质量监测中 心、吉林省粮油卫生检验监测站、黑龙江粮油卫生检验监测站、北京农业质量标准与检测技术研究中心。 本标准主要起草人：谢刚、李丽、王松雪、黎睿、叶金、胡斌、倪小英、张月、佟春艳、陆安祥。 LS/T6129—2017 粮油检验粮食中玉米赤霉烯酮的测定 超高效液相色谱法 1范围 本标准规定了粮食及其制品中玉米赤霉烯酮超高效液相色谱法测定的原理、试剂与仪器设备、分析 步骤、结果计算等内容。 本标准适用于粮食及其制品中玉米赤霉烯酮的测定。 本标准方法玉米赤霉烯酮检出限为5μg/kg，定量限为10μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 用提取液提取试样中的玉米赤霉烯酮，免疫亲和柱净化、富集后，用超高效液相色谱荧光检测器进 行测定，外标法定量。 4试剂和仪器设备 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级用水要求。 4.1试剂 4.1.1 甲醇(CH:OH)：色谱纯。 4.1.2 乙（CH，CN）：色谱纯。 4.1.3 浓盐酸（HCI)：分析纯。 4.1.4 氯化钠（(NaCI)：分析纯。 4.1.5 磷酸氢二钠（Na2HPO,）：分析纯。 4.1.6 磷酸二氢钾（KH,PO,）：分析纯。 4.1.7 氯化钾(KCI)：分析纯。 4.1.8 吐温-20：分析纯。 4.1.9 9乙腈/水（90：10）：取90mL乙腈（3.1.2）加10mL水。 4.1.10 磷酸盐-吐温20缓冲液（PBST缓冲液）：称取8.0g氯化钠（4.1.4）、1.2g磷酸氢二钠（4.1.5）、 0.2g磷酸二氢钾（4.1.6）、0.2g氯化钾（4.1.7）加人800mL水，加人2mL吐温-20（4.1.8），用浓盐酸 （4.1.3）调节pH为7.0，最后用水定容为1L。 1 LS/T6129—2017 其他试剂符合GB/T602的要求。 4.2标准品 4.2.1玉米赤霉烯酮（Zearalenone）标准品：纯度≥98%；或经国家认证并授予标准物质证书的标准 物质。 4.2.2 2玉米赤霉烯酮标准储备溶液：采用有证标准物质溶液作为储备液；或准确称取玉米赤霉烯酮标 准品（4.2.1)0.1mg（精确至0.01mg），用甲醇溶解并定容至10mL，配成浓度为10mg/L的标准储备 液。一20℃避光保存。 4.2.3玉米赤霉烯酮标准工作溶液：根据使用需要，准确吸取一定量的玉米赤霉烯酮储备液（4.2.2），用 甲醇定容，分别配成相当于10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L的系列标准工作 液。4℃避光保存，有效期1周。 4.3材料与仪器设备 4.3.1玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。 4.3.2 定性滤纸：Φ12cmWhatman4号，或性能相当者。 4.3.3 玻璃纤维滤纸：g9cmWhatmanGF/A，或性能相当者。 4.3.4 滤膜：0.22μm孔径，有机相。 4.3.5 注射器：20mL。 4.3.6 离心管：50mL。 4.3.7 三角瓶：250mL。 4.3.8 离心管。 4.3.9 高速粉碎机。 4.3.10 高速均质器：转速6500r/min~24000r/min。 4.3.11 氮气吹干仪。 4.3.12 天平：感量0.1g和0.01mg。 4.3.13 离心机：转速≥5000r/min。 4.3.14 调速多用振荡器（振荡频率≥150次）。 4.3.15 空气压力泵。 4.3.16 试验筛：1mm孔径。 4.3.17 液相色谱柱：C18柱，（柱长50mm或100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或性能相 当者。 4.3.18超高效液相色谱仪：包括超高效液相色谱仪、超高压液相色谱仪和超高速液相色谱仪，配备荧 光检测器和数据处理系统。 色谱参考条件： 色谱柱：C18柱（4.3.17）。 流动相：A：甲醇，B：水；等度洗脱，A：B=60：40。 流速：0.2mL/min。 进样量：5μL。 柱温：35℃。 荧光检测波长：激发波长305nm；发射波长460nm。 2 LS/T 6129—2017 5分析步骤 5.1扦样与分样 按GB5491执行，在采样过程中，注意防止样品污染。 5.2样品制备 5.2.1提取 样品用高速粉碎机（4.3.9）粉碎，过1mm孔径试验筛（4.3.16），混合均匀后，取有代表性样品不少 于500g，供检测用。准确称取25.0g（精确到0.1g)充分混匀的试样，置于均质杯或250mL三角瓶中， 30min，用定性滤纸（4.3.2)过滤或转移25mL的提取液于50mL的离心管中，于5000r/min离心 5min。准确移取5mL(Vz）滤液或离心管的上层液体并加入45mL(V3）PBST缓冲液（4.1.10）稀释混 匀，玻璃纤维滤纸（4.3.3）过滤或于7000r/min离心10min，滤液或离心液备用。 5.2.2净化 将免疫亲和柱（4.3.1)与20mL注射器（4.3.5）下端连接，准确移取20mL（V.）滤液于注射器中，将 空气压力泵（4.3.15)与注射器另一端连接，调节压力使溶液以约1滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直 至空气进入亲和柱中，用10mL水淋洗亲和柱2次，流速为1滴/s～2滴/s，弃掉全部流出液，抽干免疫 亲和柱。准确加人1mL(V)甲醇（4.1.1)洗脱，收集全部洗脱液于样品瓶中，准确加人0.4mL水于样品 瓶中，涡旋混合30s，过0.22μm滤膜（4.3.4），作为待测样液备用。 序使用。 5.3标准曲线的制作 30s混匀，注人液相色谱检测分析。以玉米赤霉烯酮标准工作液浓度为横坐标，相对应色谱峰峰面积为 纵坐标，建立标准工作曲线。 5.4试样溶液的测定 待测样液（5.2.2）中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应 重新按5.2进行处理符合要求后再进样分析。待测样液中玉米赤霉烯酮的浓度为C1。液相色谱图参见 附录A。 5.5空白试验 不称取试样，按5.2的步骤做空白实验，分析得到空白试样中待测物的浓度为Co。 5.6 平行试样 按5.2的步骤，对同一试样进行平行试验测定。 6结果计算 样品中玉米赤霉烯酮的含量按式（1）、式（2)计算： 3