SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4892—2017 出口动物源性食品中雌二醇、睾酮和孕酮 残留量及稳定碳同位素比值的测定 Determination of residues and stable carbon isotope ratio of estradiol,testosterone and progesterone in foodstuff of animal origin for export 2018-04-01实施 2017-08-29发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 创涂层意真优 SN/T 4892—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民 共和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：肖陈贵、岳振峰、赵超敏、康海宁、肖锋、林黎、张毅、韩瑞阳、侯乐锡。 I SN/T4892—2017 出口动物源性食品中雌二醇、睾酮和孕酮 残留量及稳定碳同位素比值的测定 1范围 本标准第一法液相色谱串联质谱法规定了动物源性食品中睾酮、孕酮、α-雌二醇、β-雌二醇残留量 的高效液相色谱-串联质谱测定和确证方法。第二法气相色谱/燃烧炉/同位素比值质谱法规定了动物 源性食品中雌二醇、睾酮和孕酮的稳定碳同位素比值测定的气相色谱/燃烧炉/同位素比值质谱方法。 本标准第一法液相色谱串联质谱法适用于动物源性食品牛肉、牛奶、鸡肉中睾酮、孕酮、雌二醇残留 量的测定。第二法气相色谱/燃烧炉/同位素比值质谱法适用于动物源性食品牛肉、牛奶、鸡肉中残留雌 二醇、睾酮和孕酮（残留水平>10μg/kg)的稳定碳同位素比值的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 第一法 液相色谱串联质谱法 3方法原理 对于动物源食品中的激素，用β-葡糖苷醛武酶-芳基硫酸酯酶在乙酸铵缓冲液中酶解，加人氯化钠 以乙酸乙酯和乙腈提取。样品提取液以QuEChERS吸附剂净化，浓缩后以高效液相色谱-质谱/质谱仪 测定，内标法或外标法定量。 4试剂材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲酸：色谱纯。 4.3冰乙酸，色谱级。 4.4乙酸铵：色谱纯。 4.5N-丙基乙二胺吸附剂（PSA），40μm～60μm粒径范围，100A平均孔径。 4.7 无水硫酸镁，分析纯，500℃灼烧4h，置于干燥器中备用。 4.8β-葡糖苷醛酶-芳基硫酸酯酶，含β-盐酸葡萄糖醛试酶134600U/mL，芳基硫酸酯酶5200U/mL。 4.9 乙酸铵缓冲溶液：溶解7.7g乙酸铵（4.4)于480mL水中，用冰乙酸（4.3）调节溶液pH值到5.2，以 水定容至500mL。 SN/T4892—2017 4.10QuEChERS吸附剂：准确称取100mgPSA（4.5）、40mgC18（4.6）和400mg无水硫酸镁（4.7）， 储存于25mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，旋紧管盖，置于干燥箱内备用。 4.11标准物质：睾酮、孕酮、17β-雕二醇、17α-雌二醇标准物质的纯度均≥99%，参见附录A表A.1。 4.122，3，4-C13-睾酮、D9-孕酮、D2-β-雌二醇标准物质的纯度均≥95%。 4.13标准贮备液：准确称取10.0mg按其纯度折算为100%质量的各个化合物的标准物质（4.11），甲 醇溶解定容至10.0mL，溶液浓度相当于100.0mg/L，一30℃冷冻保存，有效期为12个月。 4.14标准中间溶液：准确吸取1.0mL各标准贮备溶液（4.13），以甲醇稀释并定容于100mL棕色容量 瓶，浓度相当于1.0mg/L，4℃冷藏保存，有效期为6个月。 4.15空白基质溶液：选取不含待测物的样品，按照7.1和7.2步骤操作，得到空白基质溶液。 4.16基质混合标准溶液：根据需要用空白基质溶液（4.15）稀释标准中间溶液（4.14）成适合浓度的混合 标准工作溶液，现配现用。 4.17内标贮备液：准确称取10.0mg按其纯度折算为100%质量的内标标准物质（4.12），以甲醇溶解 并定容于10mL棕色容量瓶，浓度相当于100.0mg/L，一30℃冷冻保存，有效期为12个月 瓶，浓度相当于1.0mg/L，4℃冷藏保存，有效期为6个月。 作溶液，现配现用。 4.20微孔滤膜：0.22μm，水相和有机相型。 5仪器和设备 5.17 高效液相色谱四级杆质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2电子分析天平：感量0.1mg，0.01g。 5.3减压旋转蒸发仪。 5.4旋涡混合器。 5.5 高速冷冻离心机：最大转速为10000r/min。 5.6 微量移液器：量程10μl~100μl，100μl~1000μ。 5.7 pH计。 5.8螺旋盖聚丙烯离心试管，50ml。 组织捣碎机。 5.10恒温水浴振荡器。 5.11 平板振荡器。 6试样制备与保存 6.1牛肉、鸡肉 取代表性样品1000g，应尽量避免取脂肪部分，用组织捣碎机充分粉碎均匀.均分成两份，分别装 人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18℃保存。 6.2牛奶 取代表性样品1000ml充分播匀，均分成两份，分别装人洁净容器中.密封，并标明标记，于4℃ 保存。 2 SN/T4892—2017 7测定步骤 7.1样品提取 7.1.1酶解 称取试样2g（精确到0.01g），置于50mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，准确加人20μL内标工作液 （4.19），加人8mL乙酸铵缓冲液（4.9），在均质器中高速均质30s，加人30μLβ-葡糖苷醛酶-芳基硫 酸酯酶（4.8），涡旋混匀30s，37℃振荡温育12h。 7.1.2 2提取 取出样品静置至温度降至室温。加入5.0g无水氟化钠、5mL乙酸乙酯和5mL乙腈（4.1），涡旋 混匀1min后，在4℃、9500r/min离心5min，收集上清液于另一50mL离心管。剩余部分重新加人 10mL乙腈溶液，旋紧螺旋盖，室温下平置于水平振荡器，振荡提取10min，在4℃、9500r/min离心 5min，吸取上清液层溶液，合并两次提取有机相，待净化。 7.2净化 将上述样品提取液涡旋1min，静置后移取其中10mL至另一15mL离心管。一次性将QuECh ERS吸附剂（4.10）加入样品提取液中，旋紧螺旋盖，高速涡旋1min，在4℃、9500r/min离心5min。 吸取所有有机相溶液，40℃氮气吹至近干。加人乙腈-水溶液（2：8)溶解残渣并定容于1.0mL，涡旋混 合1min，过0.22μm滤膜（4.20）。滤液供液相色谱-质谱/质谱仪测定。 3测定 7.3 液相色谱条件如下： 色谱柱：XDB-Cls柱，100mm×2.1mm（内径），粒径3.0μm或相当者。 b) 流动相：A：水B：乙腈。 c) 流速：250μL/min。 (P 柱温：35℃。 e) 进样量：10μL。 f) 梯度洗脱程序见表1。 表1液相色谱梯度洗脱程序表 A/% B/ % 时间/min 80.0 20.0 0.00 8.00 30.0 70.0 9.00 10.0 90.0 13.00 10.0 90.0 13.10 80.0 20.0 17.00 80.0 20.0 7.4质谱条件 质谱条件如下： 3