SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4877.10—2017 基因条形码筛查方法 第10部分：检疫性疫霉 DNA barcoding screening method--Part 10 :Quarantine Phytophthora 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4877.10-2017 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； -第3部分：检疫性植原体； 第4部分：检疫性茎点霉； 第5部分：检疫性拟茎点霉； 第6部分：检疫性嗜酸菌； -第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉 本部分为SN/T4877的第10部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本部分起草人：章桂明、高瑞芳、汪莹、程颖慧、王颖、黄河清。 I SN/T4877.10—2017 基因条形码筛查方法 第10部分：检疫性疫霉 1范围 SN/T4877的本部分规定了栗疫霉黑水病菌、马铃薯疫霉排腐病菌、草莓疫霉红心病菌、树莓疫霉 根腐病菌、柑橘冬生疫霉、雪松疫霉根腐病菌、首猪疫霉根腐病菌、菜豆疫霉病菌、栎树猝死病菌、大豆疫 霉病菌和丁香疫霉病菌的DNA条形码筛查。 本部分适用于栗疫霉黑水病菌、马铃薯疫霉腐病菌、草莓疫霉红心病菌、树莓疫霉根腐病菌、柑橘 冬生疫霉、雪松疫霉根腐病菌、首猎疫霉根腐病菌、菜豆疫霉病菌、栎树猝死病菌、大豆疫霉病菌和丁香 疫霉病菌的DNA条形码筛查种序列的扩增、分析及结果判定等。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法 SN/T1135.6 马铃薯腐病菌检疫鉴定方法 SN/T2080栎树猝死病菌检疫鉴定方法 SN/T2474 大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法 SN/T2617 冬生疫霉病菌检疫鉴定方法 SN/T2756 丁香疫霉检疫鉴定方法 SN/T2759 栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法 SN/T3403 菜豆疫霉检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 DNA barcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因mitochondrialcytochromecoxidasesubunitI，CoI 线粒体基因变化速率快，在其13个蛋白编码基因中，COI基因很少存在插入缺失，序列长度500bp～ 700bp，宜作为真菌DNA条形码，也是最早提出的DNA条形码片段。 3.3 内部转录间隔区序列internaltranscribedspacer；ITS 依次为：外部转录简隔区、18S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、 28S基因和基因间隔序列。内部转录间隔区是存在于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区 1 SN/T4877.10—2017 在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供 详尽的系统学分析所需的可遗传性状。 4检疫性疫霉基本信息 学名：Phytophthoracambivora（Petri)Buisman 中文名：栗疫霉黑水病菌 学名：Phytophthora erythrosepticaPethybridge 中文名：马铃薯疫霉绯腐病菌 学名：PhytophthorafragariaeHickman 中文名：草莓疫霉红心病菌 学名：PhytophthorafragariaeHickmanvar.rubiW.F.WilcoxetJ.M.Duncan 中文名：树莓疫霉根腐病菌 学名：PhytophthorahibernalisCarne 中文名：柑橘冬生疫霉 学名：PhytophthoralateralisTuckeretMilbrath 中文名：雪松疫霉根腐病菌 学名：Phytophthora medicaginisE.M.Hans.etD.P.Maxwell 中文名：首循疫霉根腐病菌 学名：PhytophthoraphaseoliThaxter 中文名：菜豆疫霉病菌 学名:Phytophthora ramorum Werres,De Cock et Man in't Veld 中文名：栎树猝死病菌 学名：Phytophthora sojae Kaufmann etGerdemann 中文名：大豆疫霉病菌 学名：Phytophthorasyringae（Klebahn)Klebahn 中文名：丁香疫霉病菌 分类地位：藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae）。 各检疫性疫霉寄主范围参见附录A。 5方法原理 使用COI基因和ITS片段作为11种疫的DNA条形码基因，通过对检测对象的DNA进行 PCR扩增及产物测序后.利用DNA条形码数据库生物条形码数据（BOLD）、中国检疫性有害生物 DNA条形码数据库或NCBI数据库比对.根据序列相似度筛查物种。 6主要仪器设备与试剂 6.1仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅、4℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳 仪、凝胶成像系统。 2 SN/T4877.10—2017 6.2试剂 乙醇、CTAB提取液、三氯甲烷、PCRTaqDNA聚合酶、PCRTaq缓冲液、dNTP、DNA标记物、无 菌超纯水。 7检测与鉴定 7.1DNA提取与纯化 对真菌进行液体培养或平板培养，CTAB法对基因组DNA的提取方法详见附录B，测定DNA浓 度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。 7.2DNA条形码片段PCR扩增 利用通用引物进行COI基因和ITS片段序列扩增（具体步骤见附录C)，测序。 7.3序列分析 测序结果利用BioEdit等生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去 掉两端引物部分序列。利用BOLD在线数据库、中国检疫性有害生物DNA条形码数据库或NCBI在 线数据库比对COI基因和ITS片段序列。 8结果判定 ITS和COI序列长度大于500bp。若两个基因与DNA条码数据库、NCBI数据库和中国检疫性 有害生物DNA条形码数据库中检疫性疫霉序列相似度均大于99%,即可以筛查判定是该物种。11种 检疫性疫霉ITS和COI基因参考序列见附录D。 若判定为目标检疫性疫霉，应结合SN/T2759、SN/T2474、SN/T2617、SN/T2756、SN/T1131、 SN/T3403、SN/T1135.6、SN/T2080.无相应标准的按照常规真菌鉴定方法进行最终鉴定。 9 样品保存 9.1样品保存 可将菌丝移到V8培养基上，放入15℃冰箱中保存；也可将分离到的菌丝移入V8液体培养基中， 在25℃下生长一周左右，然后倾去培养液，把菌丝放入冻存管在一80℃保存。 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。 3 SN/T4877.102017 附录A （资料性附录） 检疫性疫霉寄主范围 A.1 冬生疫霉病菌 柑橘属（Citrusspp.）植物，如甜橙（Citrussinensis（L.）Osbeck）、脐橙（Citrussinensis（L.） Osbeck）、橘子（Citrusreticulata）、柠檬（Citruslimon（L.）Burm.f.）等，还可侵染甜椒（Capsicum annuumL.）、番茄（LycopersiconesculentumL.）、茄子（SolanummelongenaL.）、苹果（Maluspumila Mill.）、玫瑰（Rosa）、杜鹃（Rhododendron）、芝麻（SesamumindicumL.）、红花（Carthamustinctorius L.）、贝壳杉（AgathisaustralisSalisb.）、白雪松（Chamaecyparislawsoniana）等。 A.2 2大豆疫霉病菌 大豆(Glycinemar(L.)Merr)。 A.3栗黑水疫霉病菌 挪威械（Acerplatanoides）、花束月季（Andromedafioribunda）、欧洲栗（Castaneasativa）、木麻黄 （Casuarinaequisetifolia）、菊花（Chrysanthemumcinerariifolium）、欧石楠属（Ericaspp.）、山毛 （Fagussylvatica）、覆盆子（Rubusidaeus）、瓜叶菊（Seneciocruentus）等。 A.4马铃薯疫排腐病菌 马铃薯（Solanumtuberosum）。 A.5丁香疫霉病菌 柑橘属的柠檬（Citruslimon（L.）Burm.f.）、脐橙（Citrussinensis（L.）Osbeck）