SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4749——2017 犬传染性肝炎检疫技术规范 Quarantine protocol for infectious canine hepatitis 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4749—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局 本标准主要起草人：熊炜、张舒亚、王艳、张强、蒋静、王巧全、李健、黄忠荣。 SN/T4749—2017 犬传染性肝炎检疫技术规范 1范围 本标准规定了犬传染性肝炎PCR和Real-timePCR检测的操作方法。 本标准适用于犬传染性肝炎流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3概述 犬传染性肝炎（infectiouscaninehepatitis，ICH）是由犬传染性肝炎病毒（infectiouscaninehepatitis virus，ICHV)引起的急性败血性传染病，以马鞍型高热，严重血凝不良，肝脏受损，角膜混浊等为主要临 床特征。本病发生没有季节性，各种年龄和品种的犬均可感染，但以断乳后至1岁以内的犬多发，6周 龄～7周龄的犬发病率和致死率最高。ICHV还可引起熊、狐的脑炎。犬传染性肝炎病毒（ICHV)又称 为I型犬腺病毒（CanineadenovirustypeI,CAV-I)，ICHV无囊膜，核衣壳直径为70nm～80nm，呈二 十面体立体对称，其基因组为线状双链DNA，长约30kb～31kb.有30个开放读码框，基因组大小在不 同的血清型存在差异。 4试剂和材料 4.1Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/ul，一20℃保存，避免反复冻融。 4.2dNTP：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。 4.3PCR引物：浓度为20μmol/L，扩增基因片段大小为510bp，其序列如下： 引物(ICHVF):5'GCAAGCAGTTCAACCTCCAGC3'； 引物(ICHVR):5'GGTCCAGTCCATAGAGTTACAG3'。 4.4Real-timePCR的引物和探针：引物浓度为20uμmol/L，探针浓度为10umol/L.其序列如下： 上游引物(TICHVF):5"TCCCTGCCAACACTACAAACCTA3； 下游引物(TICHVR):5'GGTAAAGCTCCACCCTCTGAATC3'。 记FAM和TAMRA。 4.5DNA分子量标准：适合检测分子量大小100bp～1000bp间的DNA片段，一20℃保存。 4.6生理盐水：常温保存（见A.1）。 4.710%十二烷基硫酸钠：常温保存（见A.2）。 4.8蛋白酶K贮备液：4℃保存（见A.3）。 4.95XTBE电泳缓冲液：常温保存（见A.4）。 SN/T 4749-2017 4.10EB溶液：4℃保存（见A.5）。 4.116倍加样缓冲液：4℃保存（见A.6）。 5仪器与设备 5.1PCR仪：ABI9700或相同功能PCR仪。 5.2荧光PCR仪：ABI7700、ABI7500或相同功能荧光PCR仪。 5.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度>13000g。 5.4水平电泳仪。 5.5凝胶成像系统。 6病料的采集及处理 便加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检。口鼻腔拭子、粪拭子用少量生 理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。ICHV阳性对照样品 和阴性对照样品采用同样的方式与待检样品平行进行处理，待检备用。 7DNA抽提 取上清液465μL，加人25μL10%十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴摇 床上放置2h；加人等量的饱和酚溶液500μL，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；加人等量 的酚；三氟甲烷；异戊醇（25：24：1），振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液：再加人等量的三氯 甲烷：异戊醇（24：1），振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；最后加人两倍体积的无水乙醇， 上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清，室温干燥后，加人50μL双蒸水溶解沉淀，即得DNA模 板，一20℃保存备用。ICHV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行DNA抽提。另外， DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。 8PCR检测及结果判定 8.1PCR检测 在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5uL、Taq酶 0.5μL、DNA模板2μL、上游引物（ICHVF）和下游引物（ICHVR)各0.5μL、三蒸水18.5μL配制PCR 检测体系。阳性和阴性对照样品的检测体系同样配制，加人相应的核酸。配制液混匀后，置PCR仪上 按如下程序扩增：首先94℃变性2min；再94℃/30s、56℃/30s、72℃/40s进行35个循环；最后 平板放人水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面（电泳缓冲液工作浓度为0.5倍TBE）。取10μL PCR产物加人2μL6倍加样缓冲液，混匀后加人凝胶平板的样品孔，同时设定DNA分子量标准对照。 5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达凝胶平板底部时停止。用凝胶成像系统观察并拍摄结果。 8.2结果判定及描述 8.2.1经引物对ICHVF和ICHVR扩增，ICHV阳性对照管内的PCR产物会出现单一的510bpDNA 片段：阴性对照管内PCR产物没有该大小DNA片段扩增，否则此次试验无效。 2 SN/T 4749—2017 8.2.2若检测样品的PCR产物出现单一的510bpDNA片段，则判定犬染性肝炎病毒核酸阳性。 8.2.3若检测样品的PCR产物未出现510bp的DNA片段，则判定犬染性肝炎病毒核酸阴性。 9 Real-timePCR检测及结果判定 9.1J Real-timePCR检测 在0.2mLPCR薄壁管或八联管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL、 Taq酶0.5μL、DNA模板2μL、引物（TICHVF、TICHVR）各0.5μL、TaqMan探针（ICHV-P)0.5μL、 三蒸水18μL，配制Real-timePCR检测体系。同时，设置检测体系相同但用三蒸水代替DNA模板的 空白对照、检测体系相同DNA模板分别为ICHV阳性核酸和阴性核酸的对照。配制液混匀后，置荧光 PCR仪上按如下程序扩增：首先94℃变性2min；再94℃/20s、56℃/20s、72℃/30s进行5个循环； 然后94℃/20s、59℃/40s进行40个循环，并在该过程的第二步收集荧光信号。 9.2结果判定及描述 9.2.1空白对照、ICHV阳性对照和阴性对照，其扩增曲线应满足如下条件： a）空白对照和阴性对照Ct>38； b）阳性对照出现典型的阳性扩增曲线，且Ct≤35。 否则此次实验视为无效。 9.2.2若检测样品的Ct>38，则判定犬染性肝炎病毒核酸阴性。 9.2.3若检测样品的Ct≤35，且出现典型的扩增曲线，则判定犬染性肝炎病毒核酸阳性 9.2.4若检测样品的Ct>35且≤38，或虽然Ct≤35但扩增曲线不显著，则应对样品进行复检；若复检 后，Ct≤38则判定犬染性肝炎病毒核酸阳性，Ct>38则判定犬染性肝炎病毒核酸阴性。 10 综合判定 10.1经PCR检测扩增出的目的大小DNA片段，应通过核酸序列测定，并与标准参考序列（参见 附录B)比对进行确诊。 10.2对Real-timePCR检测阳性的样品，应进一步采用PCR方法并测序进行确诊。 3 SN/T 4749—2017 附录A （规范性附录） 试剂配制 A.1生理盐水 称取9g无水氯化钠溶解并定容于1000mL三蒸水中，分装后，经121℃15min高压灭菌备用。 A.210%十二烷基硫酸钠(SDS） 在90mL三蒸水中溶解10g十二烷基硫酸钠（电泳级），加热至60℃助溶，用盐酸调pH值至7.8， 加三蒸水定容至100mL。 A.3蛋白酶K贮备液（20mg/mL） 每升三蒸水中加人三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.21g、乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg，十二烷基硫酸 钠（SDS)5.0g，用盐酸调pH值至7.8。取该溶液，按每毫升20mg加人蛋白酶K，充分溶解后分装。 A.45×TBE电泳缓冲液 每升蒸馏水中加人三羟甲基氨基甲烷（Tris)54.0g乙二胺四乙酸（EDTA)2.9mg，硼酸27.5g，用 5.0mol/L的盐酸调pH值至8.0.配制成5×TBE电泳缓冲浓缩液作为储备液。再将该储备液用蒸馏 水进行10倍稀释，制备成工作浓度0.5×TBE电泳缓冲液备用。 A.5EB溶液 称取溴化乙锭（EB)粉末，用蒸馏水配制成浓度为10mg/mL的EB溶液，4℃保存备用。使用时， 每100mL琼脂糖凝胶溶液中，加人5μLEB溶液。 A.66倍电泳上样缓冲液 每100mL三蒸水中加人溴酚蓝0.25g和蔗糖40g，充分溶解后备用。 SN/T 4749—2017 附录B （资料性附录） PCR扩增的犬传染性肝炎病毒核酸片段序列 PCR扩增的