SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3536.2—2017 出口食品中酸性橙T号的检测方法 第2部分：液相色谱-质谱/质谱法 Determination of acid orange I in food for export--Part 2:LC-MS/MS method 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 刮涂屋迹真优 SN/T 3536.2—2017 前言 本部分是SN/T3536《出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》的第2部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：陈冬东、姜冰、刘永、吴博隆、吴岩。 SN/T3536.2—2017 出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法 第2部分：液相色谱-质谱/质谱法 1范围 SN/T3536的本部分规定了食品中酸性橙ⅡI号检测的液相色谱-质谱/质谱法 本部分适用于枣糕、黄鱼、柑橘、橙汁、熏肠、红瓜子、火锅底料、辣椒碎、小米、红枣酸奶及腐竹中酸 性橙Ⅱ号的检测和确证。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法提要 试样中的酸性橙Ⅱ号用乙睛匀浆提取，经弱阴离子小柱（WAX)弱阴离子交换固相萃取柱净化后， 用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。 4试剂与材料 除非另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2 2甲醇：色谱纯。 4.3 氨水：含量为25%~28%。 4.4冰乙酸。 4.5 乙酸铵。 4.6 氯化钠。 4.7无水硫酸钠：经650℃灼烧4h，冷却后在干燥器中储存备用。 4.8无水硫酸钠柱：用内径约为1.5cm的下部收口玻璃管，收口处填装少量玻璃棉，然后填装无水硫 酸钠，高度约为1.5cm左右， 4.9乙酸铵溶液（5mmol/L）：准确称取0.193g乙酸铵于500mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度， 混匀后备用。 4.10乙酸铵溶液（20mmol/L，pH=4）：准确称取0.770g乙酸铵于500mL容量瓶中，用水溶解并定 容至刻度，混匀勾后冰乙酸（4.4)调至pH=4，备用。 至100mL。 4.125%氨水-甲醇溶液：量取5mL氨水（4.3），用甲醇（4.2)定容至100mL。 1 SN/T3536.2—2017 4.13弱阴离子固相萃取（SPE)柱：60mg，3mL或性能相当者。使用前依次用3mL甲醇、3mL乙酸 铵溶液（4.10）活化。 4.14酸性橙Ⅱ号标准物质：C16HN2NaO.SCAS号633-96-5，纯度大于或等于99.0%。 （4.1）配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，标准储备液可在一18℃条件下储存6个月。 4.16酸性橙Ⅱ号标准工作溶液：分别准确移取一定体积的标准储备溶液，根据需要用5mmol/L乙酸 铵-乙（4.11）稀释成50ng/mL，100ng/mL，150ng/mL，200ng/mL，250ng/mL的标准工作溶液， 0℃～4℃冰箱保存，有效期为一周。 4.17微孔滤膜：0.22μm，有机系。 5仪器和设备 5.1 液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仪：配有电喷雾离子源（ESD 5.2 分析天平：感量分别为0.0001g和0.01g。 5.3[ 固相萃取装置。 5.4 旋转蒸发器。 5.5 氮吹仪。 5.6 旋涡混匀器。 5.7 组织捣碎机。 5.8 均质器：转速不低于10000r/min。 5.9 离心机：转速不低于4000r/min。 6试样的制备与保存 6.1试样制备 6.1.1橙汁、酸奶 取代表性样品约500g，混匀，装人洁净容器，密封并标明标识 6.1.2枣糕、熏肠、火锅底料、辣椒碎、小米、腐竹 取代表性样品约500g，取可食部分，经粉碎机粉碎，混匀，装人洁净容器，密封并标明标识。 6.1.3黄鱼、柑橘、红瓜子 将黄鱼、柑橘和红瓜子样品或去皮、壳、骨等（不可用水洗涤），取可食部分约500g，切碎或经粉碎机 粉碎，混匀，装入洁净容器，密封并标明标识。 6.2试样保存 枣糕、橙汁、红瓜子、辣椒碎、小米、酸奶和腐竹试样可于0℃～4℃保存，黄鱼、柑橘、熏肠和火锅底 料试样于一18℃冷冻保存。 在抽样和制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生含量的变化。 2 SN/T3536.2—2017 7测定步骤 7.1提取 称取5g（精确到0.01g)均匀试样，置于50mL具塞离心管中，加人5g氯化钠（4.6)和20.0mL乙 （4.1），均质提取1min，4000r/min离心5min。将上层清液过无水硫酸钠柱（4.8）于100mL浓缩瓶 中，下层及残渣再用20mL乙腈（4.1)重复提取一次，合并提取液于同一浓缩瓶中，在40℃水浴中用旋 净化。 7.2净化 将上述待净化液全部转移至经过预活化的弱阴离子固相萃取柱（4.13)中，控制流速在1mL/min～ 2mL/min，再分别用2mL及1mL20mmol/L乙酸铵溶液（4.10）洗涤浓缩瓶，过固相萃取柱，弃去流 出液。依次用3mL水、1mL甲醇淋洗固相萃取柱，最后用3mL5%氨水-甲醇溶液（4.12）洗脱，控制 流速在1mL/min～2mL/min，收集洗脱液于15mL刻度离心管中，洗脱液经40℃氮气仪吹干后，用 1.00mL5mmol1/L乙酸铵-乙腈溶液（4.11)振荡溶解残渣后过-0.22-μm滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱 测定。 7.3基质标准工作溶液的制备 取空白样品，按7.1和7.2操作至“洗脱液经40℃氮气仪吹干后”，加人1.00mL浓度分别为 50ng/mL，100ng/mL，150ng/mL，200ng/mL，250ng/mL的标准工作液，经0.22μm滤膜过滤，供 液相色谱-质谱/质谱测定。 7.4液相色谱-质谱/质谱条件 液相色谱-质谱/质谱条件如下： 色谱柱：ACQUITYUPLC?CHMBEHCis1.7μm，2.1mm(内径)×50mm，或相当者； b) 流动相：A：乙腈，B：5mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱程序参见表A.1； c) 流速：0.25mL/min； d) 柱温：30℃； e) 进样量：5μL； f) 离子方式：电喷雾电离（ESI)，负离子； g) 扫描方式：多反应监测（MRM)； 质谱/质谱参考条件参见表A.1和表A.2。 7.5液相色谱-质谱/质谱检测 值均应在仪器测定的线性范围内，若超出线性范围应适当稀释，同时用相同稀释倍数的基质标准工作液 进行定量。样品基质对标准工作液有一定影响，建议样品处理后尽快检测。 7.6液相色谱-质谱/质谱确证 如果样液与标准工作溶液的质量色谱图中，在相同保留时间有色谱峰出现，允许偏差小于土2.5%， 3 SN/T3536.22017 所选择离子的丰度比与标准品对应离子的丰度比，其值在允许范围内（允许范围见表1），则可判断样品 中存在酸性橙Ⅱ号。在上述色谱条件下，酸性橙Ⅱ号的液相色谱-质谱谱图参见图B.1。 表1使用定性液相色谱-质谱/质谱时相对离子丰度最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对偏差/% ±20 ±25 ± 30 ± 50 7.7 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 8 结果计算和表述 用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式（1)计算样品中酸性橙Ⅱ号的含量，计算结果需 扣除空白值。 pxVxA X= ...( 1 ) AXm 式中： X 试样中待测组分含量，单位为微克每千克（ug/kg）； 基质标准工作溶液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)； V一样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； A试样中待测组分的峰面积； A,- 一基质标准工作溶液中待测组分的峰面积； m 最终样液所代表的试样质量，单位为克（g）。 9 测定低限、回收率 9.1 测定低限 本方法中酸性橙IⅡ号的定量限为10.0μg/kg。 9.2回收率 采用本方法对枣糕、黄鱼、柑橘、橙汁、黑熏肠、红瓜子、火锅底料、辣椒碎、小米、红枣酸奶及腐竹11种 食品基质进行添加回收率试验，酸性橙Ⅱ号的添加浓度和回收率参见表C.1。 SN/T3536.2—2017 附录A （资料性附录） 色谱和质谱参考条件1) 表A.1 梯度洗脱程序表 时间 流动相A 流动相B min % % 0.00 30 70 0.80 30 70 1.00 70 30 2.00 70 30 2.20 30 70 3.00 30 70 表A.2 质谱条件 电离方式 ESI 毛细管电压 2.5 kv 源温度 150 ℃ 去溶剂温度 450 ℃ 锥孔气流 氮气，50L/h 去溶剂气流 氮气，650L/h 碰撞气流 氩气，0.21mL/min 监测模式 多反应监测 表A.3 多反应监测条件 驻留时间 锥孔电压 碰撞能量 化合物 母离子 子离子 5 V eV 170.92* 0.161 40 30 酸性橙Ⅱ号 327.07 155.90 0.161 40 25 注：加*”的离子用于定量。 1） 非商业性声明：附录A所列参考质谱条件是在WatersXEVOTQ型液质联用仪上完成的，此处列出试验型号 仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试使用不同厂家或型号的仪器。