SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3306.14-2017 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法 第14部分：大肠杆菌O157：H7 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port- Part 14:Escherichia coliO157:H7 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3306.14—2017 前言 SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌； 第5部分：布鲁氏菌； -第6部分：黄热病毒； 第7部分：猴痘病毒； 第8部分：基孔肯雅病毒； -第9部分：结核分枝杆菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； 第11部分：副溶血性弧菌； 第12部分：空肠弯曲菌； 第13部分：原虫； 第14部分：大肠杆菌O157：H7。 本部分为SN/T3306的第14部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：祁军、詹曦菁、滑娜、赵欣、左锋。 I SN/T3306.14-2017 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法 第14部分：大肠杆菌0157：H7 1范围 SN/T3306的本部分规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP)法检测大肠杆菌0157： H7的检测对象、检测程序及检测结果的报告。 本部分适用于国境口岸大肠杆菌O157:H7菌株的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.36 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 WS/T230 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 WS271感染性腹泻诊断标准 人间传染的病原微生物名录（卫科教发（2006)15号） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification） TritonX-1oo：聚乙二醇辛基苯基醚 生物安全及防污染措施 4 实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通 过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。 5技术概要 根据大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异 性识别靶序列上的rfbE基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在 1 SN/T3306.14—2017 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸 根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊 程度判定结果。亦可通过加入显色液，通过颜色变化观察判定结果。 6试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 6.1引物。 根据大肠杆菌O157：H7特有的rfbE序列靶序列基因(JQ907522.1)设计一套特异性引物，包括外 引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。 外引物1（F3，5*-3"）：AACAGTCTTGTACAAGTCCA 外引物2（B3，5-3"）：GGTGCTTTTGATATTTTTCCG 内弓物1(FIP,5-3):CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT 内引物2(BIP,5'-3'):TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT 环状引物1（LF,5'-3"）：CCAGAGTTAAGATTGAT 环状引物2（LB,5"-3"）：CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC 6.2 2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。 6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.41 BstDNA聚合酶：8U/μL。 6.5 10×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH,)2SO. 100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO,、1%TritonX-100。 6.6 MgSO，溶液：25mmol/L。 6.7 甜菜碱：5mol/L。 6.8 显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。 6.9 阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。 6.10 mEC+n肉汤。 6.11 0.2mL、1.5mL、10mL塑料离心管。 6.12 吸头，配套移液器使用。 6.13 无菌勾质袋（带滤网）。 仪器和设备 7.1 移液器：量程0.1μ～2μ，0.5μ～10μ，量程10μ~100μ，量程100μ～1000μ。 7.2 高速台式离心机：≥7000g。 7.3 水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃土1℃。 7.4 恒温培养箱：36℃士1℃。 7.5拍打式匀质器。 7.6 计时器。 87 检测程序 大肠杆菌O157：H7检测程序见图1。 2 SN/T3306.14-2017 样本采集 样本的增菌及分离培养 样本前处理 模板DNA提取 LAMP反应 阴性 阳性 结果报告 经分离培养鉴定确认 图1大肠杆菌0157：H7LAMP检测程序 9操作步骤 9.1 样本采集、细菌增菌及分离培养 按照GB4789.36、WS271执行。 9.2样本前处理 9.2.1粪便样本的前处理 选取黄豆大小的成型便，每份标本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4℃冰箱保存。预处理时每份 粪便标本放置于装有6mlPBS(0.05mol/L，pH7.4)的离心管中，振荡混匀5min～10min后，500g 离心5min，收集上清，此步骤重复3次。然后上清液4000g离心10min，收集沉淀，沉淀重悬于1mL 双蒸水（ddH：())中，7000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μL（一20℃）预冷的无水乙醇中， 振荡混匀后，7000g离心2min，弃上清，此步骤重复3次，最终保留沉淀备用。水样便无需前处理，可 直接用于后续DNA提取。 9.2.2食物标本的前处理 取可疑食物约25g放入盛有225mLmEC十n肉汤的有滤网的无菌匀质袋中，用拍击式匀质器匀 质约1min～2min，将滤液在于36℃土1℃培养18h～24h，之后取该增菌液1mL加到1.5mL无菌 离心管中，7000g离心2min保存沉淀备用。 3 SN/T3306.14—2017 9.2.3 可疑菌落的前处理 分离培养后得到的可疑菌落直接用于提取DNA模板，无需前处理。 9.3 模板DNA的提取 9.3.1 加热煮沸法 向前处理后得到的沉淀中加入100μLDNA提取液；水样便直接取100μL加入100μLDNA提取 液；直接挑取1个～2个可疑菌落加入80μLDNA提取液。将上述提取混合液其置于沸水浴10min， 7000g离心2min，收集上清作为扩增模板，于一20℃保存备用。 9.3.2试剂盒提取 按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。 9.4环介导恒温核酸扩增 9.4.1反应体系 大肠杆菌O157：H7的环介导引物恒温扩增反应体系见表1。亦可选用市售商品化检测试剂盒。 表1大肠杆菌0157：H7环介导引物恒温扩增反应体系 体系加样量 试剂名称 储备液浓度 μL 10×ThermoPol缓冲液 5.0 F3引物 10 μamol/L 0.5 B3引物 10 μmol/L 0.5 FIP引物 40-μmol/L 0.8 BIP引物 40 μmol/L 0.8 LF引物 100 μmol/L 0.4 LB引物 100 μmol/L 0.4 dNTPs 10 mmol/L 7.0 甜菜碱 5 mol/ L. 12 硫酸镁溶液 150 mmol/1, 8.0 BstDNA聚合酶 8 U/μl. 1 模板 5 ddH,O 8.6 9.4.2反应过程 按照表1所述配制反应体系，上述组分加人后，轻柔混匀并短暂离心后加人10uL的凡士林（密封 液），最后将1μL的显色液加入反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。 9.4.3 空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 4 SN/T 3306.14—2017 空白对照则采用无菌水作为扩增模板。 阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。 阳性对照以含检测序列的质粒DNA作