SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T0868—2017 代替SN/T0868—2000 出口甜叶菊中总糖贰含量的测定 Determination of steviosides in stevia leaf for export 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 0868—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 比色法》。 本标准与SN/T0868一2000相比，主要技术变化如下： 修改了标准名称； -增加了高效液相色谱法作为本标准的第一法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：曲栗、曹晨、王传现、樊祥、顾莹、盛永刚、韩丽、王敏、邓晓军。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T0868—2000。 I SN/T0868—2017 出口甜叶菊中总糖贰含量的测定 1范围 本标准规定了出口甜叶菊中总糖含量的测定方法。 本标准适用了甜叶菊中总糖武的检测和确证。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 第一法 高效液相色谱法 3方法提要 试样中的总糖试用水超声提取，用带有紫外检测器的液相色谱仪（波长200nm）测定，以色谱峰的 保留时间定性，外标法定量。 4试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2乙腈-水溶液（78十22，体积比）：取78mL的乙腈，加人22mL的水，混匀。 4.3 标准物质：甜菊糖试(CAS号57817-89-7)纯度≥98%。 4.4 标准物质：瑞鲍迪试A(CAS号58543-16-1)纯度≥98%。 4.5 标准物质：瑞鲍迪试C(CAS号63550-99-2)纯度≥98%。 4.6 标准物质：杜克武A(CAS号64432-06-0)纯度≥98%。 4.7 标准物质：甜菊双糖试(CAS号41093-60-1)纯度≥93%。 4.8甜菊糖试标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取甜菊糖武标准物质10.0mg（精确至0.1mg），用 4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存6个月。 4.9瑞鲍迪武A标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取瑞鲍迪试A标准物质10.0mg（精确至 0.1mg），用4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存6个月。 瑞鲍迪武C标准储备溶液：1.0mg/mL。 准确称取瑞鲍迪武C标准物质10.0mg（精确至 4.10 0.1mg），用4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存6个月。 4.11杜克武A标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取杜克A标准物质10.0mg（精确至0.1mg），用 4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存6个月。 4.12甜菊双糖标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取甜菊双糖标准物质10.0mg（精确至 0.1mg），用4.2溶液溶解，并定容至10mL。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存6个月。 1 SN/T0868—2017 4.13总糖试混合标准中间溶液：1.0mg/mL。分别准确吸取甜菊糖试、瑞鲍迪武A、瑞鲍迪C、杜克 武A和甜菊双糖标准储备溶液2mL于10mL容量瓶中，配制成浓度为1.0mg/mL混合标准中间溶 液。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存3个月。 4.14总糖武混合标准工作溶液：根据需要吸取适量混合标准中间溶液，用4.2溶液稀释成适当的混合 标准工作溶液。混合标准工作溶液现用现配。 5仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。 5.2 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子（ESI)源。 5.3 分析天平：感量为0.1mg和0.01g。 涡旋混合器 5.5 离心机：转速不低于4000r/min。 5.6 超声波清洗器。 6分析步骤 6.1 试样处理 称取约0.5g试样（精确至0.001g）于50mL离心管中，用水定容至50mL，振荡，超声提取15min， 吸取500μL，加人500μL乙睛振荡混匀，15000r/min离心5min，过0.22μm有机相滤膜，供HPLC 测定。 6.2＇液相色谱测定 6.2.1色谱参考条件 色谱参考条件如下： 色谱柱：氨基柱，250mm×4.6mm（内径），5μm，或性能相当者。 b) 柱温：室温。 c) 流动相：乙睛-水（78十22，体积比）。 d) 流速：0.8mL/min。 e) 检测波长：220nm。 f) 进样量：10μL。 6.2.2 色谱测定 在仪器最佳工作条件下，用标准工作溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横 坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测 定线性范围内。在上述色谱条件下，混合标准溶液色谱图参见附录A。 6.3液相色谱-质谱/质谱确证 6.3.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a） 色谱柱：氨基柱，150mmX4.6mm（内径），5μm，或性能相当者。 b) 流动相：乙睛-水（78十22，体积比）。 2 SN/T 0868—2017 c) 流速：0.5mL/min。 d）进样量：5μL。 6.3.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： 电离方式：电喷雾电离，负离子。 扫描方式：选择反应监测（SRM)。 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量 ) 以使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件参见附录B中表B.1，五种甜菊糖武标准溶液的 多反应监测（MRM)色谱图见附录C。 6.3.3定性测定 按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准 品一致，定量测定时采用标准曲线法测定。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对 离子丰度允许偏差不超过表1的规定的范围，则可判定样品中存在对应的被测物。 5种甜菊糖试标准溶液的多反应监测色谱图参见附录C。 表1液相色谱-串联质谱法确证试验时相对离子丰度的最大允许偏差 >50 >20~50 >10~20 ≤10 相对离子丰度/% 允许的相对偏差/% ±20 ±25 ± 30 ±50 6.43 空白试验 除不加试样外，均按以上操作步骤进行。 7 结果计算和表述 试样中甜菊糖试的含量按式(1)进行计算： CXV X = X 100 .(1) mx1000 式中： x 试样中甜菊糖武的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）； c 样液中甜菊糖试的测定值，单位为微克每毫升（ug/mL）； V 试样的最后定容体积，单位为毫升（mL）： 试样质量，单位克（g)； m 1000 由μg/mL换算成mg/mL的换算因子； 100 由mg/g换算成mg/100g的换算因子。 甜菊糖武、瑞鲍迪武A、瑞鲍迪试C、杜克A和甜菊双糖武各组分之和即为总糖武含量。 8 定量限和回收率 8.1 定量限 甜叶菊中的甜菊糖武、瑞鲍迪贰A、瑞鲍迪武C、杜克武A和甜菊双糖武的定量限为0.05%。 SN/T0868—2017 8.2回收率 试样添加浓度及回收率试验数据见表2。 表2试样中甜菊糖试、瑞鲍迪贰A、瑞鲍迪贰C、杜克贰A和甜菊双糖武的回收率 回收率范围/% 添加浓度/% 甜菊糖试 瑞鲍迪试A 瑞鲍迪武C 杜克试A 甜菊双糖武 0.05 81.6~92.8 82.8~95.2 84.8~104.2 84.8~103.6 80.2~91.2 0,5 83.4~101.6 80.8~93.4 83.4~98.6 82.4~94.2 78.6~101.2 5.0 82.4~94.6 82.4~106.4 80.8~96.2 82.8~95.2 79.6~92.2 第二法 比色法 9方法提要 甜叶菊叶经沸水煮泡，用硫酸铝沉淀和正丁醇提取，以除去样品中色素、还原糖及其他杂质，得到的 总糖试水溶液与蒽酮-硫酸溶液共同加热，生成绿色的络合物，比色法测定样品中的总糖武，外标法 定量。 10试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 10.1 、硫酸铝：化学纯。 10.2 水饱和正丁醇：将正丁醇用水饱和后备用。 10.3 葱酮显色剂：精确称取0.20g葱酮，溶于100mL75%硫酸溶液中（需用时现配）。 10.4 标准物质：甜菊糖戒（CAS号57817-89-7)纯度98%。 10.5标准物质：瑞鲍迪A(CAS号58543-16-1)纯度≥98%。 10.6 标准物质：瑞鲍迪C（CAS号63550-99-2)纯度≥98%。 10.7 标准物质：杜克贰A(CAS号64432-06-0)纯度≥98%。 10.8 标准物质：甜菊双糖武（CAS号41093-60-1)纯度≥93%。 10.9 甜菊糖贰标准储备溶液：2.5mg/mL。准确称取甜菊糖试标准物质25mg（精度至0.1mg），用水 溶解并定容至10mL。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存6个月。 10.10瑞鲍迪A标准储备溶液：2.5mg/mL。准确称取瑞鲍迪试A标准物质25mg（精确至 0.1mg），用水溶解并定容至10mL。所配制溶液于0℃～4℃冰箱可保存6个月。 10.11瑞鲍迪武C标准储备溶液：2