ICS 67.040 LS X 11 中华人民共和国粮食行业标准 LS/T 6126—2017 粮油检验 粮食中赭曲霉毒素A的测定 超高效液相色谱法 Inspection of grain and oils-Determination of ochratoxin A in grains- Ultra-high performance liquid chromatography 2017-10-27 发布 2017-12-20实施 国家粮食局 发布 LS/T6126—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC270）归口。 本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、吉林省粮油卫生检验监测站、遂宁市粮食质量监督检验 站、北京农业质量标准与检测技术研究中心。 本标准主要起草人：谢刚、黎睿、李丽、王松雪、辛媛媛、叶金、徐振斌、李小明、王媛媛、陆安祥。 LS/T6126-—2017 粮油检验 粮食中赭曲霉毒素A的测定 超高效液相色谱法 1范围 本标准规定了粮食及其制品中曲霉毒素A的超高效液相色谱法测定的原理、试剂与仪器设备、 分析步骤、结果计算等内容。 本标准适用于粮食及其制品中赭曲霉毒素A的测定。 本标准方法赭曲霉毒素A的检出限为0.5μg/kg，定量限为1μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，免疫亲和柱净化、富集后，超高效液相色谱荧光检测器测定， 外标法定量。 4试剂与仪器设备 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级用水要求。 4.1试剂 4.1.1 甲醇(CH:OH)：色谱纯。 4.1.2 乙腈（CHCN)：色谱纯。 4.1.3 氯化钠(NaCI)：分析纯。 4.1.4 磷酸氢二钠（Na2HPO,）：分析纯。 4.1.5 磷酸二氢钾（KH2PO,）：分析纯。 4.1.6 氯化钾(KCI)：分析纯。 4.1.7 浓盐酸(HCI)：分析纯。 4.1.8 乙酸（CH;COOH)：色谱纯。 4.1.9 碳酸氢钠（NaHCO：）：分析纯。 4.1.10 吐温-20：分析纯。 4.1.11 乙腈十水（60十40）：60体积乙腈（4.1.2）和40体积水混合。 4.1.12 酸化甲醇：1体积的色谱级乙酸（4.1.8)和99体积的甲醇（4.1.1)混合。 1 LS/T6126—2017 4.1.13真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠（4.1.3）、5.0g碳酸氢钠（4.1.9)溶于水中，加0.1mL 吐温-20(4.1.10），用水稀释至1L。 4.1.14磷酸盐缓冲液：8.0g氯化钠（4.1.3)、1.2g磷酸氢钠（4.1.4)、0.2g磷酸二氢钾（4.1.5）、0.2g氯 化钾（4.1.6)溶解于约990mL水中，用浓盐酸（4.1.7)调节pH至7.0，用水稀释至1L。 其他试剂应符合GB/T602的要求。 4.2标准品 4.2.1赭曲霉毒素A标准品：纯度>99%；或经国家认证并授权标准物质证书的标准物质。 4.2.2赭曲霉毒素A标准储备液：使用有证标准物质溶液；或准确称取适量的赭曲霉毒素A标准品 （4.2.1），用甲醇溶解，配成浓度为100μg/L的标准储备液，一20℃避光保存。 4.2.3赭曲霉毒素A标准工作溶液：准确移取适量的赭曲霉毒素A标准储备液（4.2.2），用流动相稀 释，配成浓度为1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的标准工作溶液。 4.3材料与仪器设备 4.3.1 赭曲霉毒素A免疫亲和柱。 4.3.2 定性滤纸：Φ12cmWhatman4号，或性能相当者。 4.3.3 玻璃纤维滤纸：Φ9cmWhatmanGF/A，或性能相当者。 4.3.4 滤膜：0.22μm孔径，有机相。 4.3.5 注射器：20mL。 4.3.6 离心管：50mL。 4.3.7 三角瓶：250mL。 4.3.8 量筒。 4.3.9 高速粉碎机。 4.3.10 高速均质器：转速6500r/min~24000r/min。 4.3.11 氮气吹干仪。 4.3.12 天平：感量0.1g和0.01mg。 4.3.13 离心机：转速≥5000r/min。 4.3.14 调速多用振荡器（振荡频率150次）。 4.3.15 空气压力泵。 4.3.16 试验筛：1mm孔径试验筛。 4.3.17 液相色谱柱：C18柱（柱长50mm或100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或性能相 当者。 4.3.18超高效液相色谱仪：包括超高效液相色谱仪、超高压液相色谱仪和超高速液相色谱仪，配备荧 光检测器和数据处理系统。 色谱参考条件： 色谱柱：C18柱（4.3.17）。 柱温：35℃； 流动相：乙腈十水十冰乙酸（96十102十2）。 流速：0.3mL/min。 进样量：10μL。 荧光检测器：激发波长310nm，发射波长465nm。 2 LS/T6126—2017 5分析步骤 5.1扦样与分样 按GB/T5491执行，在采样过程中，注意防止样品污染。 5.2样品制备 5.2.1提取 样品用高速粉碎机（4.3.9）粉碎，过1mm孔径试验筛（4.3.16），混合均匀后，取有代表性样品不少 于500g，供检测用。准确称取25.0g（精确到0.1g)充分混匀的试样，置于均质杯或250mL三角瓶中， 加入100mL(V,）乙睛水溶液（4.1.11），高速均质提取2min，或者使用调速多用振荡器（4.3.14）振荡提 取30min，用定性滤纸过滤或转移25mL的提取液于50mL的离心管中，在5000r/min下离心 5min。准确移取4mL(V2）滤液或离心管上层液体加入26mL(V.）磷酸盐缓冲液（4.1.14），混合均匀 后，于8000r/min离心10min，上清液备用。 5.2.2净化 将免疫亲和柱（4.3.1)与20mL玻璃注射器（4.3.5）下端连接，将上述30mL(V,）的上清液分两次全 部注入注射器中，将空气压力泵（4.3.15与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约1滴/s的流速缓慢通 和柱，弃掉全部流出液，抽干免疫亲和柱。 准确加入1.5mL洗脱液（4.1.12)或免疫亲和柱厂家推荐的洗脱液进行洗脱，流速约为1滴/s，收集 全部洗脱液于干净的玻璃试管中，在45℃下以氮吹仪用氮气吹至净干。准确加入0.5mL流动相溶解 残渣，涡旋混合30s，过0.22μm滤膜（4.3.4），作为待测样液备用。 程序使用。 5.3标准曲线的制作 赭曲霉毒素A标准工作溶液（4.2.3)由低到高注人液相色谱检测分析。以曲霉毒素A标准工作 液浓度为横坐标，相对应色谱峰峰面积为纵坐标，建立标准工作曲线。 5.4试样溶液的测定 待测样液（5.2)中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应重 新按5.2进行处理符合要求后再进样分析。待测样液中赭曲霉毒素A的浓度为C1。液相色谱图详见 附录 A。 5.5空白试验 不称取试样，按5.2的步骤做空白实验，分析得到空白试样中待测物的浓度为co。 5.6平行试验 按5.2步骤，对同一试样进行平行试验测定。 3