SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3306.10—2017 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法 第10部分：炭疽芽孢杆菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier portPart 10:Bacillus anthracis 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 玉国家质量监督检验检疫总局 SN/T3306.10—2017 ！ 前言 SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 一第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌； —第5部分：布鲁氏菌； —第6部分：黄热病毒； 一第7部分：猴痘病毒； 第8部分：基孔肯雅病毒； 第9部分：结核分枝杆菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； 一第11部分：副溶血性弧菌； 第12部分：空肠弯曲菌； -第13部分：原虫； —第14部分：大肠杆菌0157：H7。 本部分为SN/T3306的第10部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫 局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：祁军、王飞、朱俊贤、潘娟、王馨。 I SN/T3306.10—2017 5技术概要 根据炭疽芽孢杆菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特 异性识别靶序列上的BAS3788基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链 合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出 的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液 中的浑浊程度判定结果。亦可加人显色液，通过观察颜色变化判定结果。 6试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 6.1引物。 根据炭疽芽孢杆菌特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内 引物2和环状引物1,环状引物2。 外引物1(F3,5'-3":GTAATCCTCTGTTAAAACACGACGC 外引物2(B3,5'-3")：TGCTGTTGTTTGTTGGGATGGT 引物1(FIR,5'-3'）：TGGAGAATTGTGGTTCTCTAAGCCGTTTCAGTGTAATCTTTAGG GTGTAATGTG 内引物2(BIP,5’，-3)：AATTCCATTCTTACAGCGGTTTCCGTTTAGCGATGGGGTGGAAT ACTAAG 环状引物1(LF，5"-3"）：GCGGTGAGGTAGCGAGTTACT 环状引物2(LB,5'-3'):GATGTTTTCGTCCAAGTATTATCTG 6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCI(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。 6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.4BstDNA聚合酶：8U/μL。 6.510×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L（NH)2SO,、100mmol/I KCI、20 mmol/L MgSO,、1% Triton X-100。 6.6MgSO，溶液：25mmol/L。 6.7甜菜碱：5mol/L。 6.8显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。 6.9F 阳性对照：含目的片段的DNA。 6.100.2mL、1.5mL和10mL塑料离心管。 6.111 吸头，配套移液器使用。 7仪器设备 7.1移液器：量程0.1μ~2μ，量程0.5μl～10μl，量程10μl100μ，量程100μ~1000μ。 7.2高速台式离心机：≥7000g。 7.3水浴锅或加热模块：65℃士1℃和100℃±1℃。 2 SN/T 3306.10—2017 7.4计时器。 检测程序 8 炭疽芽孢杆菌LAMP检测程序见图1。 样本采集 样本的增菌及分离培养 样本前处理 模板DNA提取 LAMP反应 阴性 阳性 结果报告 经分离培养鉴定确认 图1 炭疽芽孢杆菌LAMP检测程序 9 操作步骤 9.1 样本采集与处理 按照SN/T2358、SN/T1214执行。 9.2 模板DNA的提取 按照SN/T2358执行，也可按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。 3 SN/T 3306.102017 9.3 环介导恒温核酸扩增 9.3.1 反应体系 炭疽芽孢杆菌环介导引物恒温扩增反应体系见表1。 表1炭疽芽孢杆菌环介导引物恒温扩增反应体系 体系加样量 试剂名称 储备液浓度 μL 10×ThermoPol缓冲液 5.0 10 μmol/L 0.5 F3引物 0.5 B3引物 10 μmol/L FIR引物 40μmol/L 0.8 BIP引物 40umol/L 0.8 LF引物 100μmol/L 0.4 LB引物 100μmol/L 0.4 10mmol/L 7.0 dNTPs 5mol/L 12 甜菜碱 150mmol/L 8.0 硫酸镁溶液 8U/μL BetDNA聚合酶 1 模板 5 O"HPP 8.6 9.3.2 反应过程 按照表1所述配制反应体系，上述组分加入后，轻柔混匀并短暂离心后加人10μl.的凡士林（密封 液），最后将1μL的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。 9.3.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 空白对照采用无菌水作为扩增模板。 阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。 阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板。 9.4 结果观察 取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判 SN/T3306.10—2017 断结果。 9.5 结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下： 阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则报告为LAMP检测阳性。如需通过分离培养鉴定 a) 对上述检测结果进行确认，可按SN/T2701执行。 b) 阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则报告为LAMP检测阴性。