SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1173—2015 代替SN/T1173—2003 鸡病毒性关节炎检疫技术规范 Quarantineprotocol foravian viral arthritis 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 鸡病毒性关节炎检疫技术规范 SN/T1173—2015 * 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029） 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)68533533 网址www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1字数26千字 2016年7月第一版 2016年7月第一次印刷 印数1—1100 * 书号：155066·2-30288 定价18.00 0元 SN/T1173—2015 前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1173—2003《鸡病毒性关节炎抗体检测方法 酶联免疫吸附试验》。本标准与 SN/T1173—2003相比，主要技术变化如下： 增加了临床诊断方法； 一增加了病原分离鉴定方法； 增加了荧光抗体法检测病原； 增加了鸡病毒性关节炎病毒核酸检测方法； 一增加了琼脂扩散试验检测鸡血清中抗鸡病毒性关节炎抗体的方法； 修改了酶联免疫吸附试验。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、华南农业 大学。 本标准主要起草人：曹琛福、陈兵、林庆燕、卢体康、杨俊兴、秦智锋、贾伟新、花群义、吕建强、 叶奕优、曾少灵。 SN/T1173—2015 鸡病毒性关节炎检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸡及其产品中鸡病毒性关节炎病毒的分离与鉴定、免疫荧光抗体检测反应、实时荧光 RT-PCR试验、琼脂凝胶免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验检疫方法的技术规范。 本标准适用于鸡病毒性关节炎病原学和血清学的检验检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 鸡病毒性关节炎 avianviral arthritis;AVA 一种由禽呼肠孤病毒（Avianreoviridae）引起的鸡的重要传染病。病毒主要侵害关节滑膜、腱鞘和 心肌，引起足部关节肿胀，腱鞘发炎，继而使胖肠腱断裂。病鸡关节肿胀、发炎，行动不便，跛行或不愿走 动，采食困难，生长停滞。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbnentassay） IFA：间接免疫荧光试验（indirectimmunofluorescenceassay） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionPCR） SPF：无特定病原体（specificpathogenfree） 41 临床诊断 4.1流行病学 禽呼肠孤病毒主要引起肉鸡发病，偶见蛋鸡和火鸡，可水平传播和垂直传播。鸡病毒性关节炎的感 染率和发病率随鸡的年龄越大，敏感性越低，10周龄之后明显降低。 1 SN/T1173—2015 4.2临床症状 呼肠孤病毒感染的临床症状和流行方式表现多样化和复杂性。 I型（吸收障碍型）潜伏期在自然感染中较难确定。病鸡以体弱，精神不振，羽毛生长不良和腿弱及 跛行为特征。1周～3周龄维鸡吸收障碍的症状包括色素沉着不良、羽毛异常、生长不均、骨质疏松、腹 泻、类便中有未消化的饲料，死亡率增加等。发病率为5%～20%，病死率一般为12%～15%。 IⅡI型（关节炎/腱鞘炎型）多发于4周～7周龄肉鸡，主要症状为踏关节上方胫骨和腱束双侧肿大， 腱移动受限，表现不同程度的跛行继而出现肠肌腱断裂。1d～7d雏鸡可见肝炎、心肌炎。病鸡可能 在1周～3周内由急性期恢复，但也可能变为慢性。病程稍长时，患肢多向外扭转，步态端珊。同时病 鸡发育不良，且长期不能恢复。发病率高达100%，但死亡率不及6%。 Ⅲ型表现吸收障碍和/或关节炎（腱鞘炎）的临床症状： 4.3病理剖检变化 患鸡关节周围肿胀，切开皮肤可见关节上部脯肠腱水肿.滑膜内常有充血或点状出血，关节腔内 含有淡黄色或血样渗出物。根据病程的长短.有时可见周围组织与骨膜脱离。成年鸡容易发生肠腱 断裂。慢性病例的关节腔内渗出物较少.腱鞘硬化和粘连，在关节远端关节软骨上出现凹陷的点状溃 烂，然后变大、融合，延伸到下方的骨质.关节表面纤维软骨膜过度增生。有的切面可见肌和腱交接部发 生不全断裂和周围组织粘连，关节腔有脓样、干酪样渗出物， 4.4病原学及组织学病理变化 参见附录A。 5病料采集与处理 5.1试剂与仪器 青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液、 5.2全血或血清 即为血清）。样品应无溶血，无细菌污染。以冷状态立即送实验室检疫，不能立肥送检的应于4 保存。 5.3组织或脏器 采集疑似病鸡富含病毒的肝、脾、肿胀的腱鞘、气管和支气管等分别于研钵中充分研磨，再加1倍～ 离心管中5000r/min离心5min，取上清液转入另一无菌1.5mL离心管中，编号，一80C保存备用。 若需采取组织免疫荧光抗体法检测脏器或组织，则直接采集疑似病鸡肝、脾、肿胀的腱鞘等以冷藏状态 立即送实验室检疫，不能立即送检的应于一80℃保存。 5.4关节腔内渗出物 1.5mL磷酸盐缓冲液（含青霉素2001U/mL，链霉素2001U/mL）中搅匀，盖上管盖并缩号，以冷减状 2 SN/T1173—2015 态立即送实验室检疫，不能立即送检的应5000r/min离心5min后取上清液一80℃保存。 5.5泄殖腔棉拭子 将棉拭子深人泄殖腔转一圈沾取泄殖腔分泌物，把棉拭子头放入盛有1.5mL磷酸盐缓冲液的无 菌离心管中（含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL）混勺，盖上管盖并编号，以冷藏状态立即送实验 室检疫，不能立即送检的应5000r/min离心5min后取上清液一80℃保存备用。 6病原的分离培养与鉴定 6.1试剂与材料 50%甘油PBS等。 试验用水应符合GB/T6682要求。 6.2仪器与设备 照蛋器、铅笔、开孔器、注射器、6号针头、剪刀、镀子、冰箱、细胞培养瓶、孵化箱、CO，培养箱等。 6.3样品的采集 样品的采集见5.25.4。 6.4病毒分离培养与鉴定——鸡胚接种 6.4.1鸡胚接种 将5日～7日龄SPF鸡胚用照蛋器照视检查，并用铅笔标记气室和胚胎位置，垂直放置在蛋架上， 钝端朝上。用5%碘酊消毒蛋壳气室后.用70%乙醇脱碘消毒。用开孔器在气室中央的蛋壳上钻一小 种后3d～5d收取死亡鸡胚，可见胚体出血，内脏器官充血或出血。存活胚发育不良，肝、脾、心脏肿 大，并含有坏死灶。第5天时将上述活胚1℃冷却.无菌收取胚体及尿囊液，可用于传代和鉴定。 6.4.2病毒的鉴定 将上述胚体和尿囊液进行荧光RT-PCR试验（见第7章）或琼脂扩散试验（见第8章）来确定是否 含有鸡病毒性关节炎病毒。 6.5病毒分离培养与鉴定——细胞培养 6.5.1接种培养 培养3d~5d。 6.5.2病毒的鉴定一间接免疫荧光抗体反应（IFA） 6.5.2.1样品制备与染色 将6.5.1所述感染病变细胞用0.25%的胰酶消化，PBS洗涤3次，用适量PBS悬浮细胞，将细胞悬 3