以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5768 —2025 马鼻肺炎检疫技术规范 Quarantine protocol for equine rhinopneumonitis 2025 -07-25发布 2026 -02-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5768—2025I前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国上海 海关、中华人民共和国乌鲁木齐海关。 本文件主要起草人：郑小龙、王群、鱼海琼、王艳、王科珂、朱来华、邓明俊、肖西志、戚一 达、辛学谦、梁成珠。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5768—2025马鼻肺炎检疫技术规范 1 范围 本文件规定了马鼻肺炎临床诊断、病毒分离、实时荧光 PCR、巢式 PCR、微量血清中和试验和 ELISA 试验方法。 本文件适用于马鼻肺炎临床诊断和实验室检测等。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE: Cytopathic effect，细胞病变。EHV-1: Equine herpesvirus-1，马疱疹病毒 1 型。EHV-4: Equine herpesvirus-4，马疱疹病毒 4 型。ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验。E. Derm 细胞 : Equine derm cell，马成纤维细胞。OD 值 : Optical density，光密度值。PBS: Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液。 PCR: Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。实时荧光 PCR: Real-time-PCR，实时荧光聚合酶链式反应。RK-13 细胞：Rabbit kidney cell，兔肾细胞。 5 实验室生物安全要求 实验室生物安全要求应符合 GB 19489 的规定，按照 SN/T 2984 的规定操作相应的试验材料。以正式出版文本为准2 SN/T 5768—20256 临床诊断 6.1 临床症状 马鼻肺炎是马属动物的一种急性发热性传染病，其病原体为亲缘关系密切的两种疱疹病毒——马 疱疹病毒 1 型（EHV-1）和马疱疹病毒 4 型（EHV-4） 。由 EHV-1 或 EHV-4 引起的感染以原发性呼 吸道疾病为特征，其严重程度随感染动物的年龄和免疫状况而不同。EHV-1 感染还可以引起比呼吸道黏膜炎症更严重的疾病，如流产、初生驹死亡或神经机能障碍，详见附录 A 中 A.2。 6.2 病理变化 马鼻肺炎患病动物的流产胎儿或神经受损动物中枢神经系统出现的组织学病变特征，可作为实 验室诊断的补充，详见附录 A 中 A.3。6.3 结果判定 根据该病的临床症状、病理变化和流行病学特征作出初步诊断，进一步确诊需要进行实验室 检测。 7 实验室检测 7.1 病毒分离 7.1.1 仪器和设备 7.1.1.1 CO2细胞培养箱 : 37 ℃。 7.1.1.2 冰箱 : 2 ℃～ 8 ℃、-20 ℃、-70 ℃。 7.1.1.3 倒置显微镜 : 10×、20×。 7.1.1.4 生物安全柜。 7.1.1.5 恒温水浴锅 : 37 ℃。 7.1.1.6 离心机。 7.1.1.7 无菌手术剪。 7.1.1.8 无菌镊子。 7.1.1.9 细胞培养瓶。 7.1.1.10 96 孔细胞培养板。 7.1.1.11 0.45 µm 无菌滤器。 7.1.1.12 微量可调移液器及配套吸头 : 10 µL、100 µL、1 000 µL。 7.1.2 试剂与材料 7.1.2.1 细胞培养液 : 配制见附录 B 中 B.1。 7.1.2.2 细胞维持液 : 配制见附录 B 中 B.1。 7.1.2.3 运输液 : 配制见附录 B 中 B.1。 7.1.2.4 胰酶。 7.1.2.5 MEM 液体培养基。 7.1.2.6 青霉素 : 配制见附录 B 中 B.3。 7.1.2.7 链霉素 : 配制见附录 B 中 B.3。 7.1.2.8 PBS（pH 7.2 ～ 7.4）: 配制见附录 B 中 B.4。以正式出版文本为准3 SN/T 5768—20257.1.2.9 RK-13 细胞。 7.1.2.10 E. Derm 细胞或原代马胎儿肾细胞。 7.1.3 样品的采集 样品的采集、保存及运输应符合 GB/T 18088 和 SN/T 2123 的相关要求。对无症状或出现呼吸道 症状的病例，采集鼻咽分泌液拭子置于含 3 mL 运输液的 10 mL 离心管中。对出现神经症状的病例， 用含 EDTA 抗凝剂的采血管无菌采取 10 mL ～ 20 mL 抗凝血。对病死病例，应立即无菌采集淋巴结、肾上腺、脾、肺等组织。对有流产胎儿的病例，应无菌采集流产胎儿的肺、肝、脾和胸腺等组织。所有样品采集后置于 4 ℃条件下，立即送实验室检测，若不能立即送检，应于 -20 ℃保存。 7.1.4 样品的处理 7.1.4.1 对鼻咽拭子，可将拭子连同 3 mL 运输液，放入 10 mL 的无菌注射器中，经 0.45 µm 的无菌 滤器过滤到无菌试管中，滤液用于接种细胞。 7.1.4.2 病死马或流产胎儿的肝、肺、胸腺和脾等组织混合后剪碎，研磨成糊状，加入 MEM 液 体培养基，制成 10% 悬液，3 000 r/min 离心 10 min，吸取上清液，加入青霉素 500 IU/mL、链霉素 500 µg/mL。怀疑有细菌污染的样品，可用 0.45 µm 的无菌滤器过滤处理。 7.1.4.3 对于抗凝全血，翻转试管使之混合，在室温下静置 1 h，吸出含有白细胞的上层血浆，1 500 r/min 离心 15 min，弃上清液，稍转动试管使白细胞悬浮于少量剩余血浆中，加入 10 mL 的灭菌 PBS （pH 7.2 ～ 7.4） ，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，然后将白细胞悬浮于 1 mL 细胞维持液中。 7.1.5 细胞培养 用细胞瓶或细胞板培养 RK-13 细胞 ( 分离 EHV-1)、E. Derm 细胞或原代马胎儿肾细胞 ( 分离 EHV-4)，可采用原代细胞培养或传代细胞培养。 7.1.6 样品接种 7.1.6.1 将经 7.1.3 处理好的样品接种到已长满的细胞单层上，每 25 cm2细胞接种 0.5 mL 样品液，或 取 50 µL 接种至 96 孔培养板。接种样品的细胞单层在 37 ℃，5% CO2下振荡吸附 1 h，吸附后弃去接 种液，用灭菌 PBS 或细胞维持液将细胞单层冲洗２遍，同时用未接种样品的细胞作空白对照。 7.1.6.2 加 5 mL 细胞维持液，置于 37 ℃，5% CO2中培养。 每天观察细胞病变 (CPE)，连续观察 5 d ～ 7 d。CPE 主要呈现细胞圆缩、拉网、折光性增强和脱落。若培养后无 CPE，应将细胞进行冻融，盲传2代 。 7.1.7 结果判定 样品接种细胞后，若 3 d ～ 7 d 内，细胞发生圆缩、拉网、折光性增强，直至细胞脱落、破碎， 可初判为疑似病毒分离阳性，对于初判为疑似阳性样品推荐应用巢式 PCR 或实时荧光 PCR 方法进行 鉴定；若盲传两代后，仍无病变则判为阴性。 7.2 实时荧光 PCR 7.2.1 仪器和设备 7.2.1.1 生物安全柜。 7.2.1.2 离心机。 7.2.1.3 核酸提取仪。以正式出版文本为准4 SN/T 5768—20257.2.1.4 荧光 PCR 仪。 7.2.1.5 冰箱 : 2 ℃～ 8 ℃、-20 ℃。 7.2.1.6 微量可调称器及配套吸头 : 10 µL、100 µL、1 000 µL。 7.2.2 试剂与材料 7.2.2.1 Trizol。 7.2.2.2 TE 缓冲液（pH 8.0）: 配制见附录 B 中 B.5。 7.2.2.3 三氯甲烷。 7.2.2.4 异丙醇。 7.2.2.5 75% 乙醇。 7.2.2.6 DNA 提取试剂盒。 7.2.2.7 荧光 PCR 试剂盒。 7.2.2.8 荧光 PCR 引物和探针，见表 1。 表 1 实时荧光 PCR 引物和探针 引物 / 探针名称引物序列（5`-3`） 目标基因 上游引物 GGG-GTT-CTT-AA