以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5765 —2025 海参及其制品鉴定方法 DNA 条形码技术 Identification protocol for sea cucumber and its products — DNA barcode 2025 -07-25发布 2026 -02-01 实施ICS 11.220 CCS B 52 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5765—2025 I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国青岛海关、临沂大学、深圳海关动植物检验检疫技术中心。本文件主要起草人：尹伟力、梁君妮、魏玮、刘云国、杨柏、张静、史青、郑晓聪、刘荭。以正式出版文本为准 以正式出版文本为准1 SN/T 5765—2025 海参及其制品鉴定方法 DNA 条形码技术 1.范围 本文件规定了楯手目（Aspidochirotida）和芋参目（Molpadida）海参及其制品 DNA 条形码技术的 鉴定方法。 本文件适用于对新鲜、冷冻、干制的海参及其制品进行海参物种或成分鉴定。 2. 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB /T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3. 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA 条形码 DNA barcode 生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA 片段。 注：本文件中指海参线粒体基因组中的 COI 基因片段。 3.2 空白对照 blank control 从基因组 DNA 提取步骤开始至 PCR 扩增和 PCR 产物检测整个过程，没有加入任何海参源性成 分的空白灭菌洁净去离子水，与其他受试的样品平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对 照没有 PCR 产物条带产生。 3.3 阳性对照 positive control 在 PCR 扩增过程中，与受试样品平行进行的对照反应，以在正常反应情况下一定能产生 PCR 产 物的 DNA 为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常。 阳性对照应有 PCR 产物带产生。3.4 阴性对照 negative control 非海参样品的其他物种样品，与受试样品平行进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否正 常，确认没有受到污染。阴性对照没有 PCR 产物条带产生。以正式出版文本为准2 SN/T 5765—2025 4. 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 cDNA ：互补 DNA（Complementary DNA） 。COI ：线粒体细胞色素 c 氧化酶亚基Ⅰ（Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I，COI） 。CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide） 。DEPC ：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate） 。 dNTP ：脱氧核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate） 。 EDTA ：乙二胺四乙酸（ Ethylenediaminetetraacetic acid ） 。 PBS ：磷酸盐缓冲盐水（Phosphate buffered saline） 。 PCR ：聚合酶链反应（Polymerase chain reaction） 。TBE ：缓冲液（tris-borate-EDTA buffer） 。Tris ：三（羟甲基）氨基甲烷［tris (hydroxymethyl) aminomethane］ 。 5. 原理 本文件利用通用引物对海参物种线粒体 COI 进行 PCR 扩增，得到目的片段进行纯化、测序。之 后经序列比对分析其同源性，根据同源性来确定物种之间的关系。 6. 仪器和试剂6.1 仪器 电子天平、低温高速离心机 （转速≥ 12 000 r/min） 、恒温水浴锅、纯水器、PCR 扩增仪、电泳仪、 电泳槽、凝胶成像仪、微量移液器（10 µL~100 µL 和 100 µL~1 000 µL） 、普通冰箱和超低温冰箱、微 量核酸蛋白测定仪。 6.2 试剂 6.2.1 试剂级别 除另有规定外，试验用水应符合 GB/T 6682 中三级水的要求，所用化学试剂均为分析纯。 6.2.2 引物 上游引物序列（ COIef）：5’-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3 ’ 下游引物序列（ COIer）：5’-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3’ 6.2.3 其他试剂 冰乙醇、异丙醇、三氯甲烷、蛋白酶 K（20 mg/mL） 、RNAase（10 mg/mL） 、乙酸钠（3 mol/L） 、 Taq DNA 聚合酶（5 U/ µL） 、MgCl2（25 mmol/L） 、dNTPs（10 mmol/L） 、PCR buffer（10×） 、琼脂糖、 标准分子量（2 000 bp） 。 7. 样品采集和处理7.1 鲜海参、即食海参直接剪取肌肉柱，用于 DNA 提取。以正式出版文本为准3 SN/T 5765—2025 7.2 取 1 只～ 2 只干海参放入无菌器皿中，加入 500 mL 无菌水，4 ℃条件冷藏 12 h ～ 24 h，直至海 参泡软，剪取肌肉柱，用于 DNA 提取。 7.3 混匀海参口服液，用于 DNA 提取。 8. 实验步骤 8.1 设立对照 阳性对照：使用任意一种楯手目或芋参目的海参样品。 阴性对照：使用非海参样品的其他物种样品。空白对照：没有加入任何海参源性成分的空白灭菌洁净去离子水。阳性对照样品和阴性对照样品需和待检样品同时进行 DNA 提取。 8.2 DNA 提取 8.2.1 鲜海参、干海参 DNA 提取 8.2.1.1 称取 100 mg 海参肌肉柱，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎或置液氮研碎，置于 1.5 mL 离心 管中。加入 400 µL 裂解液Ⅰ（见附录 A 中 A.1）和 12 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液（见 A.2） ，混匀， 置于 55 ℃水浴中 5 h ～ 8 h，期间不时轻微震动混匀。8.2.1.2 待组织消化完全，冷却至室温。 8.2.1.3 加入 600 µL 三氯甲烷，混合 3 min，静置 7 min，12 000 r/min 离心 2 min。 8.2.1.4 将上清液转移至另一洁净的 1.5 mL 离心管中，加入 500 µL 三氯甲烷，颠倒混合 2 min， 12 000 r/min 离心 2 min。8.2.1.5 将上清液转移至另一洁净的 1.5 mL 离心管中，加入 500 µL 沉淀液Ⅰ（见 A.3）混匀，静置 2 min。8.2.1.6 12 000 r/min 离心 10 min ～ 20 min，弃上清液，留沉淀。 8.2.1.7 加入 200 µL 氯化钠溶液（见 A.4） ，轻轻混匀至 DNA 完全溶解，再加入 6 µL RNA 酶，置于 37 ℃下 30 min ～ 60 min。8.2.1.8 加入 1 mL 冰乙醇和 100 µL 乙酸钠溶液（见 A.5） ，-20 ℃下放置 10 min，中间混匀一次 , 12 000 r/min 离心 10 min。8.2.1.9 弃上清液，加入 1 mL 70％冰乙醇清洗，12 000 r/min 离心 5 min。将沉淀于无菌空气中晾干， 加入 20 µL 去离子水溶解沉淀，置于 4 ℃备用。若需长期保存应置于 -20 ℃以下保存。 也可采用经验证同等效果的 DNA 提取纯化试剂盒进行核酸提取，参照说明书使用。 8.2.2 海参口服液 DNA 提取 8.2.2.1 取 10 mL 海 参 口 服 液， 加 入 6 mL 异 丙 醇 和 1 mL 乙 酸 钠（ 见 A.5） ，-20 ℃ 沉 淀 2 h， 12 000 r/min 离心 10 min，留沉淀。8.2.2.2 在沉淀中加入 600 μL 裂解液Ⅱ （见 A.6） ，6 μL 蛋白酶 K 溶液 （见 A.2 ） ，置于 55 ℃水浴中 1 h， 期间不时轻微震动混匀。8.2.2.3 10 000 r/min 离心 2 min，取上清液。在上清液中加入 500 μL 三氯甲烷，混合 2 min，10 000 r/min 离心 2 min，取上清液。8.2.2.4 在上清液中加入 2 倍体积的沉淀液Ⅱ（见 A.7） ，混合均匀，静置 1 h ～ 2 h， 8.2.2.5 12 000 r/min 离心 5 min。弃上清液，吸尽残留液，加入 100 μL 氯化钠溶液（见 A.4） ，混合 均匀，直至 DNA 完全溶解。8.2.2.6 加入 6 μL RNA 酶，55 ℃放置 10