ICS75.160.20 SH E31 中华人民共和国石油化工行业标准 NB/SH/T0860—2013 液体燃料中活细菌和真菌计数的 试验方法 过滤和培养程序 Standard practice for enumeration of viable bacteria and fungi in liquid fuels- Filtration and culture procedures 2013-10-01实施 2013-06-08发布 国家能源局 发布 NB/SH/T0860—2013 前 言 本标准使用重新起草法修改采用美国试验与材料协会标准ASTMD6974-09《液体燃料中活细菌和 真菌计数的试验方法过滤和培养程序》。 本标准与ASTMD6974-09的结构差异参见附录A，本标准与ASTMD6974-09的主要技术差异及 其原因如下： 删除了ASTMD6974-09中1.5条有关国际单位制说明的内容，因我国均采用国际单位制 单位； 删除了ASTMD6974-09中1.7条，将其安全方面的内容作为警告列于首页标题下； 关于规范性引用文件，本标准做了具有技术性差异的调整，以适应我国的技术条件，调整的 情况集中反映在第2章“规范性引用文件”中，具体调整如下： ·增加了GB/T4756石油液体手工取样法； ·用修改采用国际标准的国家标准CB/T6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》代替 ASTMD1193; ·删除了ASTMD6974-09引用标准中的ASTMD1129、ASTMD4175、ASTMD6426、ASTM F1094，因标准正文中并未涉及； 增加引用了ASTMD3508、ASTMD5245（见附录B）； 增加了有关术语和定义内容：菌落、灭菌、培养、培养基、细菌、真菌、霉菌、异养菌（见 3.1.2~3.1.9），以增加分析人员对微生物方面知识的认识； 在第7章仪器中增加了菌落计数器（见7.14），以方便计数； 在第7章仪器中增加了0.2μm滤膜（见7.15），在标准中多次用到，但ASTMD6974-09并未 列出； 删除了9.3.2中有关过滤方法A的内容，目前国内没有生产该仪器。将ASTMD6974-09标准 中的方法B及方法C在本标准中作为方法A、方法B列出； 删除了第12章关键词部分，因其不属于我国标准的内容； 程”，以方便标准使用。 为了使用方便，本标准还对ASTMD6974-09做了如下编辑性修改： -增加了附录C（资料性附录）“微生物污染的来源及防控”。 本标准由中国石油化工集团公司提出。 本标准由全国石油产品和润滑剂标准化技术委员会石油燃料和润滑剂分技术委员会（SAC/TC280/ SC1）归口。 本标准起草单位：中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院。 本标准主要起草人：赵丽萍、陶志平、张戟。 I NB/SH/T0860-2013 液体燃料中活细菌和真菌计数的试验方法过滤和培养程序 警告：本标准涉及某些有危险的材料、操作及设备，但并未对所有的安全问题提出建议。因此，用户在使用本标准 前应建立适当的安全防护措施，并确定相关规章限制的适用性。 1范围 本标准规定了采用膜过滤对常温条件下运动黏度不大于24mm/s的液体燃料的异养菌和真菌进行 检测和计数的方法。 本标准适用于液体燃料。 注：本标准中的定量测试的试验部分主要来自IP385及ASTMD5259。 本标准可在现场或实验室进行操作。 个体微生物在特定培养基上形成菌落的能力取决于计数菌种的分类学和生态学状态，培养基的化 学性质以及培养条件。因此，测试结果不应作为对绝对数值的解释，而应根据ASTMD6469与其他的参 数一同作为诊断和环境监控的一部分。 本标准提供了将燃油样品中的微生物转移到薄膜上的过滤方法、过滤体积、稀释过滤、微生物所 用的培养基以及培养温度等多个选择方案，试验的灵活性使得诊断过程简单化。当本方法用于状态检 测时，应始终选择一个相同的规程进行。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 CB/T4756石油液体手工取样法（GB/T4756—1998，eqvISO3170:1988） GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法（ISO3696:1987MOD） ASTMD3508 3水膜过滤粪大肠菌群的评价方法 ASTMD5245 微生物分析用清洁的实验室玻璃器血，试验器血和设备 ASTMD5259 通过膜过滤过程对肠球菌进行分离和计数的测试方法 ASTMD6469 燃油和燃油系统微生物污染的标准指南 ASTMD7463 燃油中、燃油与水混合体系及燃油携带水体系的微生物系统中三磷酸腺苷含量测试 方法 ASTMD7464-08生物学试验用液体燃料、相关材料和燃料系统元件的手工取样实施规程 ASTME1326用于细菌计数的非常规微生物试验的评定指南 IP385沸点小于390℃的燃油和馏分油中好氧菌含量的测定过滤和培养方法 3术语、定义和缩略语 下列术语和定义、缩略语和符号适用于本文件。 NB/SH/T0860—2013 3.1术语和定义 3.1.1 无菌的aseptic 不含活的微生物污案 3. 1.2 菌落colony 微生物在固体 长繁殖形成的肉眼可见的、具有一定形态特征的纳胞聚集体。 [选自NYT1113- 2006《微生物肥料术语》 3.1.3 灭菌 sterilization 应用 勿理或他 方法杀灭或清除一切微生物的措施 [选 （13-2006《微生物肥料术吾 3.1. 4 ation CHEMI 下，使目的微生物生长繁殖和 产生代谢产 的方法和技术。 1113-2006《微生物肥料术语） 3.1 culturemediun 制的适合微生物生长，代谢、紧殖和保存的营养基质 T1113—2006 3.1 teria 物有机体，缺乏细胞内膜， 物的主要类群之一，细菌是所不 有生物中数量最多的一 3.1. fungus ，具有真正的细服 胞内膜（细胞器） 的真核生物 3.1.8 霉茵 mold 型，具有丝状结构特 征的随丝体，并在适宜的条件下生 主成气中首丝体，具有孢子 结构。 a 3.1.9 异养菌 heterotrophic bacteria 又称有机营养菌。 生长时需要以复杂的有机物作 为营养物质，不能以二每化碳作为先长的主要碳 3.2缩略语 3.2.1 CFU colonyformingunit 菌落形成单位。 3.2.2 HPC heterotrophic plate count 异养菌的平板计数。 2 NB/SH/T0860—2013 3.2.3 MF membranefilter 薄膜过滤。 3.2.4 MEA maltextra 麦芽浸出液琼 3.2.5 RRESS TNTC roustocount 多不可计 3.2.6 VSL tryptone soyagar 胰酪 大豆 3.3 3.3.1 pumbe of CFU·L-1 升样 茵落数量。 3. 3. ber of colonies on.membranefilter 膜上的菌落数 3.3. (san) evolume filtery mL IP 的体积，mL。 4 方 m 若 水，先将水脱除。将脱 水后的 一定体积 的燃油试样以薄膜进行无菌过滤，过滤后的 IEA TSA两种琼脂培养基 ，在特定的温度下培养3d、5d检测CFU的存在，并用手动 薄膜放 或电动计 落进行计数。如果条 件允许，在培养基上根据菌落颜色、形态利微观特征来识别 菌落。 5方法应用 有害的微生物污染然减系统 然而，在燃料系统中获得这 重然从油相得到的活细菌和真菌的数量比水的小几个双量级，但油相的 些位置的样品是木现实的 微生物数量最能快速 映燃油系统的微生物污染情况。 ISTE 生长介质的选择性 1826讨论了微生物培养基的选择具有局限性， 经何培养基都会有助于 某种菌落形成而抑制其他的菌格。物理的、化学和生理因素的变化能影响活细胞的计数结果。ASTM D7463提供了一种非培养法对燃油及燃油撑带的水系统进行微生物计数的方法。 膜过滤的测试方法可以分析含量很宽的样品，根据估计样品中的细菌数量，通过稀释处理，调整 分析的准确度。 计数结果可作为诊断或常规监测的一部分，不作为燃料质量指标使用。 3 NB/SH/T0860—2013 6干扰 6.1大量的非生物学的颗粒物沉降（沉淀物）能堵塞薄膜而阻碍过滤。 6.2假定每个CFU产生于单一的微生物细胞，但实际上微生物通常形成聚集体并以单个菌落的方式存 在。因此，计数的结果可能会低估最初样品中的总菌数。 6.3微生物个体新陈代谢状态的变化受燃料中很多物理、化学因素的影响。受损的细胞或细胞分裂时 间相对长的细胞可能在测试规定的观察时间内不会形成菌落，这会造成最初燃料样品中的总菌数被 低估。 7仪器 7.1分液漏斗：玻璃制，容量500mL。 7.2量筒：玻璃制，容量100mL和1L。 7.3移液器：玻璃或经过预消毒的一次性塑料制，或使用带有一次性塑料头的可调节体积的移液器， 体积10mL。 7.4过滤薄膜：纤维素混合酯，经过预消毒的，网格状优先，直径47mm，孔径0.45μm。 注：虽然推荐过滤膜材料是纤维素的混合酯，但薄膜材料的选择将取决于个人偏好和燃料类型。 7.5过滤器，下面两种过滤器可任选其一： 7.5.1消毒注射器：适当容量，带有预消毒的过滤器。 7.5.2过滤器组件：经过预消毒处理的单个或多个的过滤器固定组