以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.9 —2019 出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法 （RAA 法） Rapid detection of fox derived ingredient in food for export Recombinase-aid amplification (RAA) method 2019 -12-27 发布 2020 -07-01 实施ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5227.9—2019I前 言 SN/T 5227—2019《出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 》分为 11 个部分： 第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； 第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 。 本部分为 SN/T 5227— 2019 的第 9 部分。 本部分按照 GB/T 1.1— 2009 的规则进行编写。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中国检验检疫科学研究院、郑州牧业经济学院、 浙江省食品药品检验研究院、中华人民共和国合肥海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国福州海关、杭州众测生物科技有限公司。 本部分主要起草人：苗丽、张九凯、张艳、张亚斌、沈泓、宗凯、罗宝正、孔繁德、郑秋月、 汪琳、郑晶、程奇。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5227.9—2019出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 1 范围 本部分规定了出口食品中狐狸源性成分的 RAA 检测方法。 本部分适用于出口食品中狐狸源性成分的定性检测。此标准所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.01%（W/W） 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403— 2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 狐狸 Vulpes 食肉目，裂脚亚目，犬科，狐亚科，狐属。通称狐狸，实际上是一类动物的统称。种类繁多，分 北极狐、赤狐、银黑狐、沙狐等。 3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术） 。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶，在恒温下（一般为 37 ~42 ℃） ，该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单 链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配 的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.1.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 Time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。以正式出版文本为准2 SN/T 5227.9—20193.2　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.2.1　RAA ：recombinase-aid amplification，重组酶介导扩增。 3.2.2　DNA ：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。3.2.3　CTAB ：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。3.2.4　Tris ：tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 3.2.5　EDTA ：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 3.2.6　dNTPs ：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。3.2.7　SSB ：single stranded DNA binding protein，单链 DNA 结合蛋白。3.2.8　SC-recA ： Streptomyces coelicolor recombinase，天蓝色链霉菌重组酶。 3.2.9　BS-recA ： Bacillus subtilis recombinase，枯草芽孢杆菌重组酶。 3.2.10 　Bsu：Bacillus subtilis ，枯草芽孢杆菌。 3.2.11 　Tricine ：N-tris [Hydroxymethyl] methylglycine，N- 三羟甲基甲基氨基酸。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板，采用狐狸的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧 光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中狐狸成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1 检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列（5 ’→3’） 扩增片段长度 靶基因 狐狸F ：ACTATGGCTGAATTATCCGCTACATACATGC 185bp线粒体细胞色素 b 基因（Cytb）R ：TCACGGTAAAACGTAGCCCATAAATGCTGTGGC P ：ATGGATCTTATGTATTCATAGAAACATGAAA[FAM-dT][THF] T[BHQ-dT]GGAATTATCTTATTG-C3spacer 注： 目的基因序列见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0） ：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。 5.2 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 =25 ： 24 ： 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70 % 乙醇（V/V） 。 5.5 TE 缓冲液（pH8.0） ：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） ，1 mmol/L EDTA（pH8.0） 。以正式出版文本为准3 SN/T 5227.9—20195.6 A Buffer（缓冲液 A） ：20 % 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/ μL SSB，300 ng/ μL recA 重组酶蛋白（SC- recA/BS-recA） ，75 ng/ μL Bsu DNA 聚合酶，75 ng/ μL Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇，250 ng/ μL 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 B Buffer（缓冲液 B） ：280 mM 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 恒温荧光检测仪。 6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机：转速≥ 12 000 r/min。 6.6 微量移液器：量程 0.5 μL~10 μL，10 μL~100 μL，20 μL~200 μL，200 μL~1 000 μL。 6.7 研钵及粉碎装置。 6.8 涡旋震荡器。 6.9 离心管： 2 mL、1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取 取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H2O 洗涤两次） ，加入 600 μL CTAB 提取缓冲液，涡旋震荡混匀后于 70 ℃温育 15 min，期间颠倒离 心 管2次~3 次；