以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.10 —2019 出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法 （RAA 法） Rapid detection of marten derived ingredient in food for export — Recombinase-aid amplification (RAA) method 2019 -12-27 发布 2020 -07-01 实施ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5227.10—2019I前 言 SN/T 5227—2019《出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 》预计分为以下部分： ——第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） ； ——第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 。 本部分为 SN/T 5227— 2019 第 10 部分。 本部分是根据 GB/T 1.1— 2009 给出的规则起草。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国拱北 海关、中华人民共和国合肥海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、杭州众测生物科技有限公司。 本部分主要起草人：苗丽、林华、罗宝正、陈静、宗凯、王娉、汪琳、郑秋月、徐淑菲、孔繁 德、程奇。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5227.10—2019出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 1 范围 SN/T 5227— 2019 的本部分规定了出口食品中貂源性成分的 RAA 检测方法。 本部分适用于出口食品中貂源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1 %（W/W） 。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403— 2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 貂 Martes 食肉目，裂脚亚目，鼬科，鼬亚科，貂属。常见的有以下几种：美洲貂、黄喉貂（青鼬） 、石貂 （榉貂） 、松貂（林貂） 、日本貂、渔貂、紫貂（黑貂） 。我国产石貂、紫貂、渔貂、黄喉貂四种。 3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术） 。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶，在恒温下（一般为 37 ℃~42 ℃） ，该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在 单链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹 配的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.1.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。以正式出版文本为准2 SN/T 5227.10—20193.2　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BS-recA ：枯草芽孢杆菌重组酶（ Bacillus subtilis recombinase） 。 Bsu：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）。 CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide） 。DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid） 。 dNTPs ：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate） 。EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid） 。RAA ：重组酶介导扩增（recombinase-aid amplification） 。SC-recA ：天蓝色链霉菌重组酶（ Streptomyces coelicolor recombinase） 。 SSB ：单链 DNA 结合蛋白（single stranded DNA binding protein） 。Tricine ：N- 三羟甲基甲基氨基酸（N-tris [Hydroxymethyl] methylglycine） 。Tris ：三羟甲基氨基甲烷 [tris（Hydroxymethyl）aminomethane]。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板，采用貂的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中貂成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1 检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列（5 ’→3’） 扩增片段长度 靶基因 貂F ：ATTCTCACCTGACCTGTTAGGAGACCCAGAC 269bp线粒体细胞色素 b 基因（Cytb）R ：TAAGGAGATCAGCTACTAGTAATCAGAACAAGC P ：ACTTCCTATTCGCATATGCTATCCTA CGA[FAM-dT]C[THF]A[BQH-dT]CCCTAATAAACTAG-C3spacer 注： 目的基因序列参见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0） ：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。 5.2 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 =25 ： 24 ： 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70% 乙醇（体积比） 。 5.5 TE 缓冲液（pH8.0） ：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） ，1 mmol/L EDTA（pH8.0） 。以正式出版文本为准3 SN/T 5227.10—20195.6 缓冲液 A ：20 % 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/ µL SSB，300 ng/ µL recA 重组酶蛋白（SC- recA/BS-recA） ，75 ng/ µL Bsu DNA 聚合酶，75 ng/ µL Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇，250 ng/ µL 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 缓冲液 B ：280 mol/L 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1　实时荧光 PCR 仪。 6.2　恒温荧光检测仪。6.3　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4　恒温水浴锅。6.5　离心机：转速大于等于 12 000 r/min。6.6　微量移液器：量程 0.5 µL~10 µL，10 µL~100 µL，20 µL~200 µL，200 µL~1000 µL。 6.7　研钵及粉碎装置。6.8　涡旋振荡器。6.9　离心管：2mL、1.5mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取 取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（6.9） （若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H2O 洗涤两次） ，加入 600 µL CTAB 提取缓冲液（pH 8.0） （5.1） ，涡旋振荡混匀后于 70 ℃温 育 15 min，期间颠倒离心管 2~3 次； 12 000 r/min 离心 5 min，取上