以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5225 —2019 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 67.050 C 53 2019 -12-27发布 2020 -07-01 实施进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快 速检测方法　多重 PCR 法 Rapid detection of five diarrheogenic Escherichia coli in food for import and export —Multiplex PCR method以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5225—2019前 言 本标准依照 GB/T 1.1— 2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国郑州海关、解放军疾病预防控制中心、中国动物卫生与流行 病学中心、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国福州海关。 本标准主要起草人 : 苗丽、王永亮、张灿、李阳、王俊杰、张秀平、党志浩、李轲、冯家旺、 郑晶。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5225—2019进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法　多重 PCR 法 1　范围 本标准规定了进出口食品中肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC） ，肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC， 又称产志贺毒素大肠埃希氏菌） ，肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC） ，肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC） ， 肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法。 本标准适用于各种进出口食品及其原料，有专门规定检验方法的除外。其它产品可参考使用本 标准。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　多重聚合酶链式反应（MPCR） Multiplex Polymerase Chain Reaction 又称多重引物 PCR 或复合 PCR，它是在同一 PCR 反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多 个核酸片段的 PCR 反应，其反应原理是模板基因序列先经高温变性成为单链，在 DNA 聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在 DNA 聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。 3.2　致泻大肠埃希氏菌 Diarrheogenic Escherichia coli 致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌，同时也是一种可经过 污染食物引起人类发病的致病菌。根据毒力因子、致病机制、流行病学特征，主要将致泻大肠埃 希氏菌分为 5 类：肠致病性大肠埃希氏菌（enteropathogenic E. coli，EPEC） ，肠出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagic E. coli，EHEC，又称产志贺毒素大肠埃希氏菌） ，肠产毒性大肠埃希氏菌 （enteroinvasive E. coli，ETEC） ，肠侵袭性大肠埃希氏菌（enteroinvasive E. coli，EIEC） ，肠集聚粘附性 性大肠埃希氏菌（enteroaggregative E. coli，EAEC） 。 4　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEC 致泻大肠埃希氏菌 Diarrheogenic Escherichia coli以正式出版文本为准2 SN/T 5225—2019EPEC 肠致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichia coli EIEC 肠侵袭性大肠埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coli ETEC 产肠毒素大肠埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coli EHEC 肠出血性大肠埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichia coli EAEC 肠集聚粘附性性大肠埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichia coli escV 蛋白分泌物调节基因 gene encoding LEE-encoded type III secretion system factor bfpB 束状菌毛 B 基因 bundle-forming pilus B stx1A 志贺毒素 I 基因 Shiga toxin one stx2A 志贺毒素 II 基因 Shiga toxin two elt 热不稳定性肠毒素基因 heat-labile enterotoxin invE 侵袭性质粒调节基因 invasive plasmid regulator astA 集聚热稳定性毒素 A 基因 enteroaggregative heat-stable enterotoxin A estIa 猪源热稳定性肠毒素基因 heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from pigs estIb 人源热稳定性肠毒素基因 heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from human aggR 集聚粘附菌毛调节基因 aggregative adhesive fimbriae regulator pic 肠定植因子基因 protein involved in intestinal colonization eae 紧密素基因 gene encoding intimin for Escherichia coli attaching and effacing ipaH 侵袭性质粒抗原 H 基因 nvasive plasmid antigen H-gene PCR 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction dNTP 脱氧核糖三磷酸 deoxyribonucleoside triphosphate 5　方法提要 本标准依据致泻性大肠埃希氏菌的致病机理，检测致病型 EPEC（bfpB、 escV） 、EIEC（invE） 、 ETEC（elt、 estIa、estIb） 、EHEC（escV 、stx1A、stx2A ） 、EAEC（astA、aggR、pic） ，采用多重 PCR 技术，根据 PCR 扩增产物的条带大小确定致泻性大肠埃希氏菌致病型别。 6　设备和材料6.1　恒温培养箱，36℃ ±1℃，42℃ ±1℃。 6.2　均质器。6.3　振荡器。6.4　无菌均质杯或无菌均质袋；容量 500mL。6.5　无菌培养皿；直径 90 mm。6.6　一次性接种环。6.7　移液器：量程分别为 1 mL、5 mL 和 10 mL，刻度为 0.1 mL。6.8　微量移液器：0.5 µL ～ 2 µL、2 µL ～ 20 µL、20 µL ～ 200 µL。6.9　灭菌 PCR 反应管。6.10　电子天平：感量 0.1 g、0.01 g。6.11　恒温水浴箱：100℃。6.12　冷冻离心机：控温 4℃～ 8℃，最大转速不小于 13 000 r/ min。6.13　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.14　PCR 扩增仪。6.15　核酸电泳仪，包括电源、电泳槽、制胶槽（长度 >10 cm）和梳子。以正式出版文本为准3 SN/T 5225—20196.16　凝胶成像系统。 7 培养基和试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。所有 试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 7.1　营养肉汤：见附录 A 中 A.1.1。 7.2　肠道菌增菌肉汤：见附录 A 中 A.1.2。 7.3　麦康凯琼脂（MAC） ：见附录 A 中 A.1.3。7.4　伊红美兰琼脂（EMB） ：见附录 A 中 A.1.4。7.5　TE 缓冲液：见附录 A 中 A.1.5。7.6　10×PCR 缓冲液：见附录 A 中 A.1.6。7.7　50×TAE 缓冲液：见附录 A 中 A.1.7。 8　检验程序 食品中五种致泻大肠埃希氏菌检验程序见图 1。 图 1　食品中五种致泻大肠埃希氏菌检验程序以正式出版文本为准4 SN/T 5225—20199　操作步骤 9.1　样品制备、增菌培养和分离 以无菌操作取检样 25 g（或 25 mL） ，加入装有灭菌 225 mL 营养肉汤的均质杯中，用旋转刀片式 均质器以 8 000 r/min ~10 000 r/min 均质 1 min~2 min ；或加入装有 225 mL 营养肉汤的均质袋中，用拍 击式均质器均质 1 min~2 min。液体样品震荡混匀即可。于 36℃ ±1℃培养 6 h。取 10 µL，接种于 30 mL 肠道菌增菌肉汤管内，于 42℃ ±1℃培养 18 h。 将增菌液划线