以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5224 —2019 出口食品中单核细胞增生 李斯特菌检验方法 实时荧光 PCR 内标法 Detection of Listeria monocytogenes in food for export —Real-time PCR with internal amplification control method 2019 -12-27发布 2020 -07-01 实施ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5224—2019前 言 本标准按照 GB/T 1.1— 2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国杭州海关、上海交通大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：李可、施春雷、王娉、史贤明、方莹、张晓峰、崔妍。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5224—2019出口食品中单核细胞增生李斯特菌检验方法 实时荧光 PCR 内标法 1　范围 本标准规定了出口食品中单核细胞增生李斯特菌的实时荧光 PCR 内标方法。 本标准适用于出口食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.30— 2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB / T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3　定义、术语和缩略语 下列定义、术语和缩略语适用于本文件。 3.1　定义和术语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 扩增内标 internal amplification control，IAC 添加到 PCR 反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建 DNA 序列或者是一段致病菌的看家基 因序列。主要原理是：在荧光定量 PCR 中使用与目的基因相似的扩增内标，它的两端引物结合序列与目的基因完全一致，但具有不同的探针结合序列，使之不能与目的基因的探针结合，只能与内标探针结合。将扩增内标添加到 PCR 反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目标序列的扩增都将受到抑制，从而达到指示 PCR 反应假阴性的目的。 3.1.2 Ct值 cycle threshold Ct 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.2　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR（polymerase chain reaction） ：聚合酶链反应。DNA（deoxyibonuleic acid） ：脱氧核糖核酸。 FAM（6-carboxyfluorescein） ：6- 羧基荧光素。以正式出版文本为准2 SN/T 5224—2019HEX（6-hexachlorofluorescein） ：6- 羧基 -2'，4，4'，5'，7，7'- 六氯荧光素琥珀酰亚胺酯。 4　方法提要 荧光 PCR 反应体系中，预先加入能同时扩增目标片段和扩增内标的引物，以及目标菌探针、内 标检测探针以及内标质粒，然后将样品 DNA 加入 PCR 反应液中进行两步法荧光 PCR 反应，在扩增 内标质粒与样品 DNA 的共同扩增中如果存在抑制现象，扩增内标的 PCR 扩增也将被抑制，从而达到 对样品的荧光 PCR 检测过程进行假阴性监控目的。 5　试剂 除另有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/ T 6682 中一级水的要求。 所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 5.1　DNA 提取试剂：DNA 提取液：20 mmol / L Tris-HCl， 2 mmol / L EDTA，1.2% Triton X-100（pH 8.0） ，也可使用商业化的 DNA 提取试剂。5.2　Taq DNA 聚合酶。5.3　dNTP 混合液。5.4　10×PCR 缓冲液：200 mmol/ L Tris-HCl（pH 8.4） ，200mmol/ L KCl，15 mmol/ L MgCl 2。 5.5　引物和探针：见附录 A。 5.6　内标质粒：参见附录 B。 6　主要仪器和设备6.1　恒温水浴锅或加热套装置：100℃。 6.2　恒温培养箱：36℃ ±1℃，30℃ ±1℃。 6.3　离心机：最大转速 13 000 r/ min 以上。6.4　天平：感量 0.1 g。6.5　冰箱：-20℃ ~4℃。6.6　均质器。6.7　可调移液器：1 µL-1000 µL。 6.8　荧光 PCR 仪。 7　检验程序 食品中单核细胞增生李斯特菌的扩增内标荧光 PCR 检测流程见图 1。 图 1 食品中单核细胞增生李斯特菌检验程序以正式出版文本为准3 SN/T 5224—20198　操作步骤 8.1　 样品制备、增菌培养 按照 GB 4789.30— 2016 中第一法进行样品制备和增菌（两次增菌） 。 8.2　 细菌模板 DNA 的制备 取 8.1 中培养的二次增菌液 1 mL，加到 1.5 mL 无菌离心管中，8 000 r / min 离心 5 min，吸弃上 清液；加入 50 μL DNA 提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取） ，混匀后沸水浴 10 min，置 冰上 10 min ；12000 r / min 离心 5 min，取上清保存于 -20℃备用以待检测。 也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒并按其说明制备模板 DNA。 8.3　 荧光 PCR 检测 8.3.1 荧光 PCR 反应体系 荧光 PCR 反应所用引物和探针见附录 A，PCR 反应体系见表 1。 也可采用商品化的 PCR 扩增体系。 每个 DNA 样品做 2 个平行管。加样时应使样品 DNA 溶液完全落入反应液中，不要粘附于壁上，加样 后尽快盖紧管盖。 表 1 PCR 反应体系 组分 工作液浓度 加样量 μL 终浓度 10×PCR 缓冲液 - 2 - dNTP Mixture （10 mmol / L） 10 μmol / L 1.6 - 引物（上游） 10 μmol / L 0.4 200 nmol / L 引物（下游） 10 μmol / L 0.4 200 nmol / L 单核细胞增生李斯特菌探 针10 μmol / L 0.6 300 nmol / L 内标质粒探针 10 μmol / L 0.6 300 nmol / L Taq DNA 聚合酶 5 U / uL 0.4 0.1 U/ uL DNA 模板 - 1 - 内标质粒 1 去离子水 - 补至 20 - 8.3.2 阳性对照、阴性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。 阳性对照采用含有检测序列的 DNA （或质粒） 和 IAC 片段同时作为荧光 PCR 反应的模板，阴性对照采用含 IAC 片段的质粒作为荧光 PCR 反应的模 板，空白对照用无菌水作为荧光 PCR 反应的模板。 8.3.3 荧光 PCR 反应程序 荧光 PCR 反应循环参数为 95℃ 4 min ； 95℃ 5 s，65℃ 20 s，45 个循环。信号采集设为 FAM、 HEX 荧光素（FAM 荧光素代表样品中单核细胞增生李斯特菌信号，HEX 荧光素代表扩增内标信号） 。以正式出版文本为准4 SN/T 5224—2019注：因不同 PCR 仪的性能差异，可通过条件优化适当调整 PCR 循环的退火温度及时间。 9　荧光阈值的确定 PCR 反应完成后应设定荧光阈值以分析样品的 Ct 值，以 PCR 反应的前 3 个 ~15 个循环的荧光信 号作为基线信号（噪音） ，荧光阈值理论上定义为基线信号的标准偏差的 10 倍，在实际应用中可以根 据仪器基线信号进行人工调整，设定原则是以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（无规则的 噪音线）的最高点，且不出现 Ct 值为准。 10　结果及判断10.1　质控标准 质控标准如下： ——空白对照：FAM 荧光素和 HEX 荧光素均无扩增曲线，C t≥ 40.0 ； ——阴性对照：FAM 荧光素无扩增曲线，Ct≥ 40.0 ；HEX 荧光素出现典型的扩增曲线，Ct值应 <35.0 ； ——阳性对照：FAM 荧光素出现典型的扩增曲线，Ct值应 <35.0 ； 否则，实验视为无效。 10.2　结果判断 按如下内容进行结果判断： —— Ct值（FAM）≥ 40.0，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出相应致病菌； —— Ct值（FAM）≤ 35.0，可判定该样品结果为阳性； —— Ct值（FAM）>35.0，而 <40，建议样本重做，再次扩增后的结果 Ct 值如果仍小于 40，并有 典型的扩增曲线，且对照结果均正常，则可判定该基因为阳性。 对于阳性结果，应对样品的二次增菌液或可疑纯菌落进一步按 GB 4789.30 中第一法操作步骤进 行确认后报告结果。 11　生物安全和防污染措施 11.1　生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行操作，所有培养物和废弃物应参照 GB 19489 中的有关规定。 11.2　防污染措施 防污染措施应符合 GB/ T 27403 的规定