以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5223 —2019 蜂蜜中 18 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱 - 荧光检测法 Determination of 18 free amino acids in honey —— HPLC -FLD method 2019 -12-27发布 2020 -07-01 实施ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5223—2019I前 言 本标准按照 GB/T 1.1— 2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈辉、彭涛、代汉慧、胡雪艳、谢瑜杰、范春林。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5223—2019蜂蜜中 18 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱 - 荧光检测法 1 范围 本标准规定了蜂蜜中 18 种游离氨基酸的高效液相色谱 - 荧光检测方法。 本标准适用于蜂蜜天冬氨酸（Asp） 、谷氨酸（Glu） 、丝氨酸（Ser） 、谷氨酰胺（Gln） 、组氨酸 （His） 、甘氨酸（Gly） 、苏氨酸（Thr） 、精氨酸（Arg） 、丙氨酸（Ala） 、酪氨酸（Tys） 、缬氨酸（Val） 、 蛋氨酸（Met） 、色氨酸（Trp） 、苯丙氨酸（Phe） 、异亮氨酸（Ileu） 、亮氨酸（Leu） 、赖氨酸（Lys） 、脯氨酸（Pro）的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 方法提要 采用定量环衍生的方法对蜂蜜中氨基酸进行衍生化处理，再用高效液相色谱 - 荧光检测法进行 测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O ）。 4.2 氢氧化钠（NaOH） 。 4.3 硼酸（BH3O3）。 4.4 乙腈（色谱纯） 。 4.5 甲醇（色谱纯） 。 4.6 浓盐酸。 4.7 邻苯二甲醛试剂（OPA） ：10 mg/mL。 4.8 9-芴甲基氯甲酸酯试剂（FMOC） ：2.5mg/mL。 4.9 氢氧化钠溶液（10mol/L） ：称取 40 g 氢氧化钠（4.2） ，溶于 50 mL 水中，冷却至室温后，用水 稀释至 100 mL，混匀。 4.10 0.1 mol/L 盐酸溶液：取 0.90 mL 浓盐酸（4.6）至 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.11 硼酸盐缓冲液：称取 2.47 g 硼酸（4.3）于 100 mL 水中，用氢氧化钠溶液（4.9）调节 pH 值至 10.2。 4.12 磷酸二氢钠缓冲溶液：称取 6.24 g 磷酸二氢钠（4.1） ，转移到 1 000 mL 玻璃烧杯中。加入 1 000 mL 超纯水，搅拌，直到所有晶体完全溶解。用氢氧化钠溶液（4.9）调节溶液 pH 值至 7.80。4.13 18 种单个氨基酸标准品（具体名称参见附录 A） ：固体，纯度不小于 98%。 4.14 混合氨基酸标准储备溶液：准确称取一定量的各种氨基酸标准品，用 0.1 mol/L 盐酸溶液 （4.10）以正式出版文本为准2 SN/T 5223—2019溶解，混匀，使其浓度为 500 pmol/ μL。 4.15 混合氨基酸标准工作溶液：准确量取混合氨基酸标准储备溶液 （4.14） ，用 0.1 mol/L 盐酸溶液 （4.10） 稀释，依次配制成浓度分别为 0.5 pmol/ μL、1 pmol/ μL、2.5 pmol/ μL、5 pmol/ μL、10 pmol/ μL、25 pmol/ μL的 标准溶液。 4.16 微孔滤膜：孔径 0.22 μm。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱仪：配有荧光检测器。 5.2 磁力搅拌器。 5.3 分析天平：感量为 0.1 mg 和 0.001 g。 5.4 pH 计。 6 测定步骤 6.1 样品准备 称取 3.0 g（精确至 0.01 g）蜂蜜样品，用适量超纯水涡旋混匀至溶解，然后用超纯水定容至 25 mL， 0.22 μm 滤膜过滤，上机检测。 6.2 测定 6.2.1 液相色谱参考条件 6.2.1.1 色谱柱：氨基酸分析柱，150 mm×4.6 mm （内径） ，3.5 μm 或相当者； 6.2.1.2 柱温：40℃ ； 6.2.1.3 自动进样器：定量环规格为 100 μL。 6.2.1.4 进样器程序：参见附录 B。 6.2.1.5 流动相 A 为磷酸二氢钠缓冲溶液（4.12） 。流动相 B 为乙腈 : 甲醇 : 水 =45 : 45 : 10（v/v/v） 。 流动相、流速及梯度洗脱条件见表 1。 表 1 流动相、流速及梯度洗脱条件 时间 /min 流动相 A/% 流动相 B/% 流速 /ml/min 0 100 0 2 1.9 100 0 2 18.1 43 57 2 18.6 0 100 2 22.3 0 100 2 23.2 100 0 2 26 100 0 2以正式出版文本为准3 SN/T 5223—20196.2.1.6 FLD 参数： —— 0 min，激发波长 =340 nm ；发射波长 =450 nm ；PTM gain=10 ； —— 15 min，激发波长 =266 nm ；发射波长 =305 nm ；PTM gain=9。 6.3 定性 依据氨基酸标准样品的保留时间，对待测样品中各氨基酸进行定性，定性色谱图参见附录 C。 6.4 定量 本方法采用外标法定量测定。样品中氨基酸响应值应在标准工作曲线线性范围内，如果超出，应 稀释。计算时标准工作溶液中各氨基酸浓度由 pmol/ μL 换算为 mg/L，相对分子质量参见附录 A。 7 结果计算和表述 试样中游离氨基酸的含量按照式（1）计算： ………………………………（1） 式中： X——试样中游离氨基酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg） ； A——被测样品中游离氨基酸的峰面积； b——标准曲线方程的截距； k——标准曲线方程的斜率； D——二次稀释倍数； V——样品的定容体积，单位为毫升（mL） ； m——试样的质量，单位为克（g） 。 8 定量限 除脯氨酸定量限为 1.0 mg/kg 外，其余游离氨基酸的定量限为 0.2 mg/kg。以正式出版文本为准4 SN/T 5223—2019附 录 A （资料性附录） 18 种氨基酸的分子式和相对分子量 表 A.1 18 种氨基酸的分子式和相对分子量 序号 中文名称 英文名称 英文缩写 分子式 相对分子质量 CAS 号 1 天冬氨酸 aspartic acid Asp C4H7NO4 133.1 1783-96-6 2 谷氨酸 glutamic acid Glu C5H9NO4 147.13 56-86-0 3 丝氨酸 serine Ser C3H7NO3 105.09 56-45-1 4 谷氨酰胺 glutamine Gln C5H10N2O3 146.14 56-85-9 5 组氨酸 histidine His C6H9N3O2 155.15 71-00-1 6 甘氨酸 glycine Gly C2H5NO2 75.07 56-40-6 7 苏氨酸 threonine Thr C4H9NO3 119.12 72-19-5 8 精氨酸 arginine Arg C6H14N4O2 174.2 74-79-3 9 丙氨酸 alanine Ala C3H7NO2 89.09 56-41-7 10 酪氨酸 tyrosine Tyr C9H11O3N 181.19 60-18-4 11 缬氨酸 valine Val C5H11NO2 117.15 72-18-4 12 蛋氨酸 methionine Met C5H11NO2S 149.21 63-68-3 13 色氨酸 tryptophan Trp C11H2O2N2 204.23 73-22-3 14 苯丙氨酸 phenylalanine Phe C9H11O2N 165.19 150-30-1 15 异亮氨酸 isoleucine Ileu C6H13NO2 131.17 73-32-5 16 亮氨酸 leucine Leu C6H13NO2 131.17 61-90-5 17 赖氨酸 lysine Lys C6H14N2O2 146.19 56-87-1 18 脯氨酸 proline Pro C5H9NO2 115.13 147-85-3