以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN / T 5216—2020 商品化试剂盒检测方法 乳酸链球菌素 方法一 Commercial kit method — Nisin —Test Method Ⅰ ICS 67.050 C 53 2020-08-27 发布 2021-03-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5216—2020前 言 本标准按照 GB/T 1.1— 2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国乌鲁木齐海关、北京勤邦生物技术有限公司。 本标准主要起草人：孟茹、周均、尚爽、罗琼、齐鑫、万宇平、梁振纲、高艳菲、牛娜。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5216—2020商品化试剂盒检测方法 乳酸链球菌素 方法一 1 范围 本标准规定了食品中乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法。 本标准适用于检测含乳饮品及肉制品等食品中乳酸链球菌素 A及乳酸链球菌素 Z的含量。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳酸链球菌素 nisin 乳酸乳球菌发酵后提取而制得的食品添加剂乳酸链球菌素，是一种多肽物质，由 34个氨基酸残 基组成。用于食品添加剂的有 Nisin A和Nisin Z两种类型： Nisin A的分子式为 C140H230O37N42S7，相 对分子量为 3 354.35 Da ；Nisin Z 的分子式为 C140H230O37N42S7，相对分子量为 3 330.31 Da。两种类型 的乳酸链球菌素分子结构在第 27位的氨基酸不同， Nisin A第27位氨基酸为组氨酸， Nisin Z第27 位氨基酸为天冬酰胺。 4 方法提要 样品中的乳酸链球菌素和试剂盒中微孔条上预包被的抗原竞争乳酸链球菌素抗体，加入酶标二 抗后，用底物显色液显色，样本吸光值与所含乳酸链球菌素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以 其对应的稀释倍数，即可得出样品中乳酸链球菌素的含量。 5 材料和试剂 除另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 乳酸链球菌素检测试剂盒。试剂盒评价参见 SN/T 2775，具体评价结果参见附录 A。试剂盒组成 如下： a） 96孔酶标板：12 条× 8孔（包被偶联抗原） ；以正式出版文本为准2 SN/T 5216—2020b） 乳酸链球菌素标准品：0 mg/L 、0.1 mg/L 、0.5 mg/L 、2.5 mg/L 、12.5 mg/L 、62.5 mg/L ； c） 高浓度标准品：100 mg/L ； d） 酶标记物浓缩液； e） 抗体工作液； f） 浓缩清洗液； g） 样品提取液； h） 显色液：底物 A、底物 B； i） 终止液。 试剂盒应在 4℃～8℃避光条件下保存，溶解后的酶标记物应在 -15℃条件下冻存。 5.2 盐酸。 5.3 氢氧化钠。 5.4 正己烷。 6 仪器 6.1 天平：量程 100 g,感量 0.01 g。 6.2 酶标仪：波长 450 nm。 6.3 涡旋仪。 6.4 离心机。 6.5 混合振荡器。 6.6 单道移液器： 20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL、500 μL～5 000 μL。 6.7 多道移液器： 30 μL～300 μL。 6.8 聚苯乙烯离心管： 2 mL、10 mL、50 mL。 6.9 研钵或粉碎装置。 7 试样的制备和提取 7.1 牛奶、饮料类液体样品：用样品提取液将样本稀释 10倍，取 50 μL用于分析。样品稀释倍数为 10。 7.2 乳制品、肉制品类固体样品：称取 25 g（精确到 0.01 g）样品，用研钵或粉碎装置将样品制成 粉末状或直径小于 0.3 mm的颗粒状，称取 1 g（精确到 0.01 g）粉末状制备好的样品至 50 mL离心管 里，加入 5 mL样品提取液，旋涡振荡混匀 5 min，3 000 r/min 离心 5 min后静置 10 min，提取上清 1 mL至离心管里 (注意不要吸到表层的油脂和底层的沉淀 )，取 50 μL用于分析。样品稀释倍数为 5。 8 分析步骤 8.1 操作条件 所有操作应在室温下（ 20℃～25℃）进行，乳酸链球菌素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至 室温后方可使用。 8.2 洗板条件 8.2.1 人工洗涤次数 4次，每次注入洗涤工作液 250 μL/孔。 8.2.2 自动洗板预定 4次。 8.3 酶标仪测定条件以正式出版文本为准3 SN/T 5216—2020酶标仪测定波长为 450 nm。 8.4 测定步骤 8.4.1 将测定需用的微孔板条插入微孔架上，标记标准液和样品等在微孔架上的位置。 8.4.2 吸取 50 μL乳酸链球菌素标准工作溶液 （浓度分别为： 0 mg/L、0.1 mg/L 、0.5 mg/L 、2.5 mg/L 、 12.5 mg/L 、62.5 mg/L ）和样品溶液于对应的微孔中。 8.4.3 每孔加入 50 μL抗体工作液，振荡混匀，用封孔膜封孔条，置 37℃避光环境中反应 30 min。 8.4.4 揭开封孔膜，倒掉孔中的溶液，加洗涤工作液，按 8.2条件进行洗板。将微孔架反扣在吸水纸 上反复拍打，除去孔内残留的洗涤工作液。 8.4.5 吸取 100 μL酶标记结合物溶液到每个微孔中，振荡混匀，用封孔膜封孔后置 37℃避光环境 中反应 30 min，重复 8.4.4洗涤微孔。 8.4.6 吸取 100 μL显色液到每个微孔中，振荡混匀，用封孔膜封孔后置 37℃避光环境中反应 15 min。 8.4.7 吸取 100 μL终止液到每个微孔中，振荡混匀，将微孔架置于酶标仪中，在 450 nm处测量吸 光度 OD值。 8.5 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 8.6 空白试验 除不称取试样外，用水做空白按 8.4测定步骤进行。 9 结果计算 9.1 读取 OD值，按（1）计算每一标准溶液和样品的百分吸光度值（B）： 百分吸光度值 B=B1/B0×100% ……………………………（1） 式中 ： B1——标准品或样品溶液的平均吸光度值； B0—— 0 mg/L标准溶液的平均吸光度值。 9.2 以标准品百分比吸光度值为纵坐标（ %） ，乳酸链球菌素标准溶液浓度（ mg/L）为横坐标，绘制 标准工作曲线，将样品的百分吸光度代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的乳酸链球菌素 的浓度后，结果按式（2）计算： X=c×V ……………………………（2） 式中： X——样品中乳酸链球菌素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c—— 从标准工作曲线上得到的样品中乳酸链球菌素浓度，单位为毫克每毫升（mg/L）； V——样品的稀释倍数。 也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数。 9.3 若样品 B值高于标准工作溶液的 B值范围，应对样品进行稀释后重新测试。以正式出版文本为准4 SN/T 5216—202010 确证试验 如被测样品中乳酸链球菌素含量大于限量要求，应用其他方法进行确证。 11 方法性能指标 11.1 检出限和定量限 检出限 2.0 mg/kg（mg/L ） ；定量限 6.0 mg/kg（mg/L ）。 11.2 交叉反应率 乳酸链球菌素 100%；纳他霉素 <0.1%；苯甲酸钠 <0.1%；聚萘氨酸 <0.1%；山梨酸钾 <0.1%； 对羟基苯甲酸 <0.1%；多粘菌素 B<1%；多粘菌素 E<1%；万古霉素 <1%；缬氨霉素 <1%；平阳霉 素<1%；环孢菌素 A<1%。 11.3 回收率 11.3.1 牛奶、饮料、乳制品（液态）回收率如下： ——添加量为 1 μg/mL时，回收率为 78.6%～110.6%； ——添加量为 30 μg/mL时，回收率为 98.7%～117.9%； ——添加量为 300 μg/mL时，回收率为 79.4%～116.5%。 11.3.2 肉制品、乳制品（固态）回收率如下： ——添加量为 0.5 μg/mL时，回收率为 93.1%～105.9%； ——添加量为 10 μg/mL时，回收率为 75.8%～116.3%； ——添加量为 100 μg/mL时，回收率为 88.2%～112.4%。