以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5214 —2020 伯乐树鉴定方法 Identification of Bretschneidera sinensis Hemsl. 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65. 020. 01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5214—2020I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 给出的规则起草。 本文件中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国大连 海关。 本文件主要起草人：于文涛、陈乃中、崔博采、李敏、李明福、王有福、虞赟、许瑾、李佳。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5214—2020伯乐树鉴定方法 1 范围 本文件规定了伯乐树的鉴定方法。 本文件适用于伯乐树的鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3　术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 蒴果 capsule 由合生心皮的复雌蕊发育成的果实，子房 1 室或多室，每室有多粒种子。 3.1.2 中轴胎座 axial placentation雌蕊是由多心皮构成，各心皮互相连合，在子房里形成中轴与隔膜，子房室数和心皮数相同， 胚珠着生在中轴上。 3.1.3 总状花序 raceme 无限花序的一种。其特点是花轴不分枝，较长，自下而上依次着生许多有柄小花，各小花花柄等 长，开花顺序由下而上。 3.1.4 羽状复叶 pinnate 小叶在叶轴的两侧排列成羽毛状的复叶称为羽状复叶。 3.1.5 皮孔 lenticel树木枝干表面、肉眼可见的一些裂缝状的突起。为茎与外界交换气体的孔隙。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。bp ：碱基对（base pair）以正式出版文本为准2 SN/T 5214—2020CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide） dNTP ：脱氧核糖核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）OD ：光密度值（optical density） Taq酶：栖热水生菌 DNA 聚合酶 4　基本信息 伯乐树的基本信息如下： 中文名：伯乐树，钟萼木，冬桃，钟古树 学名： Bretschneidera sinensis Hemsl. 异名： Bretschneidera yunshanensis Chun & F.C. How 英文名：Boleshu分类地位：隶属伯乐树科 Bretschneideraceae、伯乐树属 Bretschneidera Hemsl.。伯乐树为单型科， 即伯乐树科内仅伯乐树属一属，伯乐树属内仅伯乐树一种。 伯乐树其他信息参见附录 A。 5　方法原理 伯乐树可能以果实、种子、植株残体、植物标本和幼苗等形式进出境。伯乐树种子、叶等形态特 征及标准 DNA 条码是鉴定该种的主要依据。其中种子和叶片等形态特征均完整时以形态特征作为鉴定依据，种子或叶片等形态特征不完整时以分子特征作为鉴定的主要依据。 由于伯乐树科为单型科，鉴定为伯乐树科即为鉴定为伯乐树。 6　设备和试剂 6.1 设备及器具 体视显微镜、电子天平、放大镜、解剖刀、解剖针、镊子、指形管、培养皿、白瓷盘、棉花、 样品袋、标本夹、标签、记录纸、标本瓶、标本盒、常规 PCR 仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶 成像系统、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、冰箱、冷冻混合研磨仪、微量移液器（2 μL，10 μL，20 μL，100 μL，200 μL， 1000 μL） 、离心管（2 mL） 、PCR 反应管（0.2 mL，0.5 mL） 。 6.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNA Marker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷 酸（dNTP） 、Taq 聚合酶、10×PCR 缓冲液、防虫剂、樟脑精、干燥剂、CTAB 法提取试剂（参见附录 B） 。 7　实验室检测 选择现场检疫截获的原始样品的一部分为待检样品，该样品数量（株数或重量） 的 1/2 至 3/4（较 少样品时）作为检验样品，剩余样品作为保存样品。送检样品不足 3 株或 1.0 kg 的全检。以正式出版文本为准3 SN/T 5214—20208　鉴定方法 8.1 形态学鉴定方法 依据伯乐树的形态特征、基于种子形态特征的伯乐树及近似属种鉴定检索表（参见附录 C）和叶 片形态特征的伯乐树及近似种分种检索表（参见附录 D 和附录 E）对疑似样品进行物种鉴定。 8.1.1 伯乐树科形态学特征 8.1.1.1 叶 叶互生，奇数羽状复叶；小叶对生或下部的互生，有小叶柄，全缘，羽状脉；无托叶。 8.1.1.2 花 花大，两性，两侧对称，组成顶生、直立的总状花序；花萼阔钟状，5 浅裂；花瓣 5 片，分离， 覆瓦状排列，不相等，后面的 2 片较小，着生在花萼上部；雄蕊 8 枚，基部连合，着生在花萼下部， 较花瓣略短，花丝丝状，花药背着；雌蕊 1 枚，子房无柄，上位，3 室 ~5 室，中轴胎座，每室有悬 垂的胚珠 2 颗，花柱较雄蕊稍长，柱头头状，小。 8.1.1.3 果实及种子 果为蒴果，3 瓣裂 ~5 瓣裂，果瓣厚，木质；种子大。 8.1.2 伯乐树形态特征（参见附录 F） 8.1.2.1 全株及茎 乔木，高 10 m~20 m，树皮灰褐色；小枝有较明显的皮孔。 8.1.2.2 叶 奇数羽状复叶通常长 25 cm ~45 cm，总轴有疏短柔毛或无毛；叶柄长 10 cm ~18 cm，小叶 7 片 ~15 片，纸质或革质，狭椭圆形，菱状长圆形，长圆状披针形或卵状披针形，多少偏斜，长 6 cm ~26 cm， 宽 3 cm~9 cm，全缘，顶端渐尖或急短渐尖，基部钝圆或短尖、楔形，叶面绿色，无毛，叶背粉绿色 或灰白色，有短柔毛，常在中脉和侧脉两侧较密；叶脉在叶背明显，侧脉 8 对 ~15 对；小叶柄长 2 mm~10 mm，无毛。 8.1.2.3 花序 总状花序长 20 cm ~36 cm ；总花梗、花梗、花萼外面有棕色短绒毛；花淡红色，直径约 4 cm， 花梗长 2 cm~3 cm ；花萼直径约 2 cm，长 1.2 cm~1.7 cm，顶端具短的 5 齿，内面有疏柔毛或无毛，花瓣阔匙形或倒卵楔形，顶端浑圆，长 1.8 cm ~2 cm，宽 1 cm~1.5 cm，无毛，内面有红色纵条纹；花 丝长 2.5 cm~3 cm，基部有小柔毛；子房有光亮、白色的柔毛，花柱有柔毛。 8.1.2.4　果实 蒴果椭圆球形，近球形或阔卵形，长 3 cm ~5.5 cm，直径 2 cm~3.5 cm，被极短的棕褐色毛和常 混生疏白色小柔毛，有或无明显的黄褐色小瘤体，果瓣厚 1.2 mm ~5 mm ；果柄长 2.5 cm~3.5 cm，有 或无毛。8.1.2.5　种子 种子椭圆球形，平滑，成熟时长约 1.8 cm，直径约 1.3 cm。以正式出版文本为准4 SN/T 5214—20208.2　分子生物学鉴定方法 8.2.1　样品的处理 将需要提取 DNA 的伯乐树植物材料（新鲜植物组织 100 mg，硅胶干燥的叶为 10 mg） ，放入 2 mL 的 EP 管中，每个管内加 2 粒钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 3 min（30 次 /s） 。 8.2.2　核酸的制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的 CTAB 法提取植物基因组总 DNA。改良的 CTAB 法参见附录 B。 PCR 级 DNA 溶液的 OD260 /OD280 比值应为 1.7~1.9。 8.2.3　DNA 条形码片段扩增 利用 rbcL 基因的通用引物进行 rbcL 基因扩增，引物序列、PCR 反应程序和 PCR 反应体系参见附 录 G。8.2.4　PCR 产物的检测 取 PCR 产物 5 μL，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。 rbcL 引物扩增可获得约 991 bp 的扩增片段。 8.2.5　测序与序列处理 取剩余的 PCR 扩增产物 45 μL，经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用 DNA 产物纯化试剂 盒纯化并测序。测序引物与 PCR 扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两 端测序质量 Q 值小于 20 的序列去除。8.2.6 标准 DNA 条码 伯乐树 rbcL 基因序列 GenBank 登录号：MG792130。 9　结果判定 9.1 形态学结果判定 以果实、种子、叶的形态特征为依据，符合第 8 章所描述的形态鉴定特征并符合基于种子形态特 征的伯乐树及近似属种鉴定检索表（参见附录 C）和基于叶片形态特征的伯乐树及近似种分种检索表 （参见附录 D）中伯乐树特征的，可鉴定为伯乐树。 9.2 分子生物学结果判定 登录 GenBank 数据库 BLAST 鉴定系统（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） ，在 BLAST 结果中 查看序列相似性最高（Max ident or Similarit