以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5212 —2020 水松鉴定方法 Identification of Glyptostrobus pensilis （Staunton ex D. Don) K. Koch 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5212—2020I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国青岛 海关。 本文件主要起草人：于文涛、陈乃中、邵秀玲、虞赟、李明福、李佳、宋涛。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5212—2020水松鉴定方法 1 范围 本文件规定了水松的鉴定方法。 本文件适用于水松的鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3　术语、定义和缩略语 3.1　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 种鳞 seminiferous scale 裸子植物大孢子叶球由大孢子叶构成，呈螺旋状排列在纵轴上，上面较大而顶部肥厚的部分叫 种鳞，也叫珠鳞或果鳞。一般认为珠鳞由大孢子叶发育而来。 3.1.2 苞鳞 bract scale 裸子植物大孢子叶球由大孢子叶构成，呈螺旋状排列在纵轴上，下面较小的薄片是苞鳞，一般 认为苞鳞是失去生殖能力的大孢子叶。 3.1.3 顶芽 terminal bud 在茎轴顶端形成的芽之总称，当幼胚进行极性分化时，最初形成的是顶芽，顶芽是最活跃的生 长点之一。 3.1.4 腋芽 axillary bud 侧芽之一种，特指从叶腋所生出的定芽。 3.2　缩略语 下列缩略语适用于本文件。bp ：碱基对（base pair）CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide）dNTP ：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）以正式出版文本为准2 SN/T 5212—2020DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） OD ：光密度值（optical density） Taq酶：栖热水生菌 DNA 聚合酶。 4　水松基本信息 中文名：水松 学名： Glyptostrobus pensilis （Staunton ex D. Don）K. Koch 异名： Glyptostrobus aquaticus （Antoine）R. Parker Glyptostrobus heterophyllus （Brongn.）Endl. Glyptostrobus sinensis A. Henry Sabina aquatica Antoine Taxodium japonicum var. heterophyllum Brongn. Taxodium sinense J. Forbes Thuja pensilis Staunton ex D. Don 英文名：Chinese Swamp Cypress , Chinese Water Fir 分类地位：隶属杉科 Taxodiaceae，水松属 Glyptostrobus Endl.。水松属为单型属，即水松属内仅 水松一种。 水松其他信息参见附录 A。 5　方法原理 水松可能以球果、种子、植株残体、植物标本和幼苗等形式进出境。水松球果、种子和叶等形态 特征及标准 DNA 条码是鉴定该种的主要依据。其中球果、种子和叶片等形态特征均完整时，以形态 特征作为鉴定依据；种子或叶片等形态特征不完整的植物组织，以形态特征作为参考，以分子特征作为鉴定的主要依据。 由于水松属为单型属，鉴定为水松属即为鉴定为水松。 6　设备和试剂 6.1 设备及器具 体视显微镜、电子天平、放大镜、解剖刀、解剖针、镊子、指形管、培养皿、白瓷盘、棉花、 样品袋、标本夹、标签、记录纸、标本瓶、标本盒、常规 PCR 仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶 成像系统、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、冰箱、冷冻混合研磨仪、微量移液器（2 μL，10 μL，20 μL，100 μL，200 μL， 1000 μL） 、离心管（2 mL） 、PCR 反应管（0.2 mL，0.5 mL） 。 6.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNA Marker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷 三磷酸（dNTPs） 、Taq 聚合酶、10×PCR 缓冲液、防虫剂、樟脑精、干燥剂。采用改良 CTAB 法提取试剂（参见附录 B） 。以正式出版文本为准3 SN/T 5212—20207　实验室检测 选择现场检疫截获的原始样品的一部分为待检样品，该样品数量（株数或质量） 的 1/2 至 3/4（较 少样品时）作为检验样品，剩余样品作为保存样品。送检样品不足 3 株或 1.0 kg 的全检。 8　鉴定方法 8.1 形态学鉴定方法 依据杉科和水松的形态特征、水松属及其近缘属分属检索表（见附录 C） 、基于种子和果实形态 特征的水松及其近似属种检索表（见附录 D）对疑似样品进行物种鉴定。 8.1.1 杉科形态特征 8.1.1.1 茎 常绿或落叶乔木，树干端直，大枝轮生或近轮生。 8.1.1.2 叶 叶螺旋状排列，散生，很少交叉对生（水杉属） ，披针形、钻形、鳞状或条形，同一树上之叶同 型或二型。8.1.1.3 球花 球花单性，雌雄同株，球花的雄蕊和珠鳞均螺旋状着生，很少交叉对生（水杉属） ；雄球花小， 单生或－簇生枝顶，或排成圆锥花序状，或生叶腋，雄蕊有（2 ~9 个） （常 3 ~4 个）花药，花粉无 气囊；雌球花顶生或生于去年生枝近枝顶，珠鳞与苞鳞半合生（仅顶端分离）或完全合生，或珠鳞 甚小（杉木属） ，或苞鳞退化（台湾杉属） ，珠鳞的腹面基部有 2 枚 ~9 枚直立或倒生胚珠。 8.1.1.4 球果 球果当年成熟，熟时张开，种鳞（或苞鳞）扁平或盾形，木质或革质，螺旋状着生或交叉对生 （水杉属） ，宿存或熟后逐渐脱落，能育种鳞（或苞鳞）的腹面有 2 粒 ~9 粒种子。 8.1.1.5 种子 种子扁平或三棱形，周围或两侧有窄翅，或下部具长翅；胚有子叶 2 枚 ~9 枚。 8.1.2 水松形态特征（参见附录 E） 8.1.2.1 全株及茎 乔木，高 8 m~10 m，稀高达 25 m。生于湿生环境者，树干基部膨大成柱槽状，并且有伸出土面 或水面的吸收根，柱槽高达 70 cm，干基直径达 60 cm~120 cm，树干有扭纹；树皮褐色或灰白色而带褐色，纵裂成不规则的长条片；枝条稀疏，大枝近平展，上部枝条斜伸；短枝从二年生枝的顶芽或多年生枝的腋芽伸出，长 8 cm~18 cm，冬季脱落；主枝则从多年生及二年生的顶芽伸出，冬季不脱落。 8.1.2.2 叶 叶多型：鳞形叶较厚或背腹隆起，螺旋状着生于多年生或当年生的主枝上，长约 2 mm，有白色 气孔点，冬季不脱落；条形叶两侧扁平，薄，常列成二列，先端尖，基部渐窄，长 1 cm ~3 cm，宽以正式出版文本为准4 SN/T 5212—20201.5 mm~4 mm，淡绿色，背面中脉两侧有气孔带；条状钻形叶两侧扁，背腹窿起，先端渐尖或尖钝， 微向外弯，长 4 mm ~11 mm，辐射伸展或呈三列状；条形叶及条状钻形叶均于冬季连同侧生短枝一同 脱落。 8.1.2.3 球果 球果倒卵圆形，长 2 cm~ 2.5 cm，径 1.3 cm~ 1.5 cm；种鳞木质，扁平，中部的倒卵形，基部楔形， 先端圆，鳞背近边缘处有 6 个 ~10 个微向外反的三角状尖齿；苞鳞与种鳞几全部合生，仅先端分离， 三角状，向外反曲，位于种鳞背面的中部或中上部。8.1.2.4 种子 种子椭圆形，稍扁，褐色，长 5 mm~7 mm，宽 3 mm~4 mm，下端有长翅，翅长 4 mm~7 mm。 8.1.2.5 幼苗 子叶 4 枚 ~5 枚，条状针形，长 1.2 cm~ 1.6 cm，宽不及 1 mm，无气孔线；初生叶条形，长约 2 cm， 宽 1.5 mm，轮生、对生或互生，主茎有白色小点。8.2 分子生物学鉴定方法 8.2.1 样品的处理 将需要提取 DNA 的水松植物材料（种子为 1 粒 ~2 粒，新鲜叶为 100 mg，硅胶干燥的叶为 10 mg） ， 放入 2 mL 的 EP 管中，每个管内加 2 粒钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 3 min（30 次 /s） 。8.2.2　核酸的制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的 CTAB 法提取植物基因组总 DNA。改良的 CTAB 法参见附录 B。 PCR 级 DNA 溶液的 OD260/OD280 比值应为 1.7~1.9。 8.2.3　DNA 条形码片段扩增 利用 rbcL 基因的通用引物进行 rbcL 基因扩增，引物序列、PCR 反应程序和 PCR 反应体系见附录 F。 8.2.4　PCR 产物的检测 取 PCR 产物 5 μL，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。 rbcL 引物扩增可获得约 991 bp 的扩增片段。8.2.5　测序与序列处理 取剩余的 PCR 扩增产物