以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5206 —2020 代替 SN/T 1162—2002 洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法 Detection and identification of onion yellow dwarf virus 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 65.020 CCS B 16 2020 -12-30发布 2021 -07-01实施以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 开本 880×1230 1/16 印张 1.25 字数 37 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1—500 书号： 155175·32 定价 20 .00 元洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法行 业 标 准 SN/T 5206—2020 * * *北京市朝阳区东四环南路甲 1 号 （100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行 网址 www.customskb.com/book以正式出版文本为准I SN/T 5206—2020前 言 本文件按照 GB/T1.1—2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国厦门海关、中国检验检疫科学研 究院、中国农业科学院生物技术研究所、福建农林大学。 本文件主要起草人：沈建国、林玲、黄智辉、张永江、李为民、陈细红、廖富荣、高芳銮、周 卫川、吴祖建、陈寿铃。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5206—2020洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法 1　范围 本文件规定了洋葱黄矮病毒检测的程序和方法。 本文件适用于进出境植物及其产品中洋葱黄矮病毒的检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T 2964 植物病毒检测规范SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4　原理 洋葱黄矮病毒的血清学特性和基因组特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 5　仪器设备、用具及试剂 5.1　仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平（1/1000 g） 、酶联仪、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽、-20℃低温冰 箱和 -80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH 计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌 锅、超净工作台等。 5.2　用具 各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL） 、PCR 反应管、离心管 （1.5 mL） 、研钵等。 5.3　试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。DAS-ELISA 试剂 见附录 A、RT-PCR 试剂见附录 B。以正式出版文本为准2 SN/T 5206—20206　抽样和样品制备 6.1　抽样 抽样方法按照 SN/T 2122 相关中规定执行。 有病毒危害症状的植物材料单独抽样，OYDV 的危害症状描述参见附录 C；无危害症状的植物材 料抽样方法按照 SN/T 2122 中相关规定执行。 6.2　样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照 SN/T 2964 和 SN/T 3457 中规定执行。 7　检测与鉴定 7.1　DAS-ELISA DAS-ELISA 具体方法见附录 A。 7.2　RT-PCR RT-PCR 具体方法见附录 B。 8　结果判定与记录 8.1　结果判定 样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行： 首先采用 DAS-ELISA 进行初步筛检。若检测结果为阳性，采用 RT-PCR 方法进行验证。若验证结果为阴性，则判定样品不携带 OYDV；若验证结果为阳性，则判定样品携带 OYDV。 若检测结果为阴性，采用 RT-PCR 方法进行验证。若验证结果为阴性，则判定样品不携带 OYDV；若 RT-PCR 验证结果为阳性，则需要将 PCR 产物进行测序，测定的序列为 OYDV 序列时判定样品携带 OYDV。 8.2　结果记录 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。DAS- ELISA 检测应有酶联反应数值；RT-PCR 检测应有电泳图片。 9　样品的保存 将经检测结果判定为阳性的样品妥善保存在 -20℃ ～-80℃冰箱中，并做好登记和标记工作，以 备复核用。以正式出版文本为准3 SN/T 5206—2020附　录　A （规范性） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） A.1　试剂 A.1.1　包被抗体 特异性的洋葱黄矮病毒抗体。 A.1.2　酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的洋葱黄矮病毒抗体。 A.1.3　底物 对硝基苯磷酸二钠（ pNPP） 。 A.1.4　1×PBST缓冲液（pH 7.4） 氯化钠（NaCl） 8.0 g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.15 g 氯化钾（KCl） 0.2 g 吐温 -20 0.5 mL 溶于 900 mL 灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL，4℃储存。 A.1.5　样品抽提缓冲液（pH 7.4） 亚硫酸钠（ Na2SO3） 1.3 g 聚乙烯基吡咯烷酮（ PVP, MW24 000 ～40 000 ） 20.0 g 溶于 900 mL 的1×PBST 中，并用 1×PBST 定容至 1 000 mL ，4℃储存。 A.1.6　包被缓冲液（pH 9.6） 碳酸钠（ Na2CO3） 1.59 g 碳酸氢钠（ NaHCO3） 2.93 g 溶于 900 mL 灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL ，4℃储存。 A.1.7　酶标抗体稀释缓冲液（pH 7.4） 牛血清白蛋白（ BSA ） 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮（ PVP, MW24 000 ～40 000 ） 20.0 g 溶于 900 mL 1×PBST 中，并用 1×PBST 定容至 1000 mL ，4℃储存。 A.1.8　底物缓冲液（pH 9.8) 二乙醇胺 97 mL 氯化镁（ MgCl2） 0.1 g 溶于 800 mL 灭菌双蒸水中，用浓盐酸（ HCl）调 pH至9.8，定容至 1 000 mL ，4℃储存。以正式出版文本为准4 SN/T 5206—2020A.2　试验方法 A.2.1　样品制备 A.2.1.1　待测样品 待测样品按 1：10（重量：体积，W/V）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，8 000 g 离心 10 min， 上清即为制备好的检测样品。A.2.1.2　阳性对照样品 洋葱黄矮病毒的纯病毒或者组织抽提液由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。 A.2.1.3　阴性对照样品 由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。 A.2.1.4　空白对照 用抽提缓冲液作空白对照 A.2.2　包被抗体 按说明用包被缓冲液将抗体稀释，加入酶联板的孔中，100 μL/ 孔，加盖，37℃孵育 2 h 或 4℃冰 箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST 洗涤 4～6 次，每次 1 min。 A.2.3　加样 加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，空白对照，并且至少一个重复，100 μL/ 孔，加 盖， 37℃孵育 2 h 或 4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST 洗涤 4～6 次。 每次 1 min。A.2.4　加酶标抗体 按说明用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中，100 μL/ 孔，加盖， 37℃孵育 2 h，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST 洗涤 4～6 次，每次 1 min。 A.2.5　加底物 将底物 ρNPP 加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL（现配现用） ，加入到酶联板中，100 μL/ 孔，室温避光孵育。A.2.6　测定光密度 酶联仪在 405 nm 处测定光密度（OD 值） 。 A.3　结果判断 在满足阴性对照孔的 OD 405值 <0.15、阳性对照孔的 OD405值 / 阴性对照孔的 OD405值 >5~10，孔的重 复性基本一致的质量要求后，样品 OD405值 / 阴性对照 OD405值 >2，判为阳性。样品 OD405值 / 阴性对照 OD405值在阈值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证。样品 OD405值 / 阴性对 照 OD405值 <2，判为阴性。