以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5205 —2020 柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Pepino mosaic virus 2020 -12-30 发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN / T 5205—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国青岛海关。 本文件主要起草人：陈青、陈红运、迟海英，林振基、方志鹏、黄峰、廖富荣、林石明。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN / T 5205—2020柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法。 本文件适用于可能带有柏平缕瓜花叶病毒的植物种子、苗木及产品的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 学名： Pepino mosaic virus 缩写： PepMV 分类地位：甲型线状病毒科（ Alphaflexiviridae ） ，马铃薯 X 病毒属（ Potexvirus ）的成员抗原特性 和基因组特征是检疫鉴定的主要依据。 详细资料参见附录 A。 5 主要仪器设备与试剂 5.1 主要仪器设备和用具 微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g） 、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽、凝 胶成像仪、高速冷冻台式离心机、制冰机、旋涡震荡器、水浴槽、pH 计、可调移液器（1000 μL、 200 μL、20 μL、2 μL） 、96 孔酶标板、研钵等。 5.2 主要试剂 主要试剂和缓冲液见附录 B、C、D。 6 检测样品的制备 6.1 种子样品制备 挑取畸形、不成熟种子在防虫网室内播于灭菌土中，待长出 3 片～ 4 片真叶后将表现症状的植株 编号，未表现症状的植株分组（10 株为 1 组）并编号，采集的真叶分成 2 份，根据需要分别用于后 续的试验。种子也可以直接检测。以正式出版文本为准2 SN / T 5205—20206.2 苗木和植物产品 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木和植物产品编号单独检测。没有症状的分组并编号 检测，分组方法和检测方法同 6.1。 7 检测与鉴定 7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ DAS-ELISA ） 设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了 PepMV 的植物组织作阳性对照） ， 样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不 同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录 B。 7.2 一步法 RT-PCR 检测 分别提取样品和对照的总 RNA，RT-PCR 一步法进行 PCR 扩增。健康的植物组织作阴性对照， 感染 PepMV 的植物组织作阳性对照，用 ddH2O 作空白对照。具体操作见附录 C。 7.3 一步法实时荧光 RT-PCR 检测 分别提取样品和对照的总 RNA，进行一步法实时荧光 RT-PCR 检测。 健康的植物组织作阴性对照， 感染 PepMV 的植物组织作阳性对照，ddH2O 作空白对照。具体操作见附录 D。 8 结果判定 酶联检测为阳性后，RT-PCR 或实时荧光 RT-PCR 检测为阳性即可判断为样品携带柏平缕瓜花叶 病毒。 9 结果记录与样品保存 9.1 结果记录 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有 经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据；PCR 检测需有电泳结果照片，实 时荧光 RT-PCR 要有扩增曲线图。 9.2 样品保存 经检验确定携带 PepMV 的样品应在合适条件下保存，种子保存在 4℃，病叶冻干保存在 -20℃或 者 -80℃冰箱中，做好标记和登记工作。以正式出版文本为准3 SN / T 5205—2020附　录　A （资料性） 柏平缕瓜花叶病毒相关资料 A.1 抗原特性 PepMV具有很强的抗原性 。 A.2 粒体形态 柏平缕瓜花叶病毒粒体为线状，长度为 500 nm ，直径为 13 nm 。 A.3 基因组 单链线性 RNA ，基因组长度 6.5kb ，基因组为单一组分，碱基比： G：A：C：U=25:26:19:30 ， 占粒子重的 6%。基因组不带 Poly（A）尾巴，而具有 tRNA-like 结构，编码 4个蛋白，病毒基因组 5′ 和3′ 端分别含有一段非编码区。 A.4 寄主范围 柏平缕瓜花叶病毒在自然界主要番茄 (Lycopersicon esculentum )、凤果（ Solanum muricatum ）。 A.5 病害症状 番茄：叶片花叶、扭曲、亮黄色花叶、皱缩、老叶上有褐斑，茎部褐色条纹，果实红斑 ， 。 A.6 分布 PepMV于1974年在秘鲁首次发现。荷兰，欧洲多个国家均有发生，包括奥地利、保加利亚、车 臣、意大利、芬兰、法国、德国、匈牙利、荷兰、挪威、波兰、斯洛伐克、西班牙、瑞典、瑞士、土 耳其和英国。 A.7 传播途径 PepMV可通过接触传播，也可通过种子传播。以正式出版文本为准4 SN / T 5205—2020附　录　B （规范性） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 B.1 试材 B.1.1 酶联板 B.1.2 包被抗体 特异性的柏平缕瓜花叶病毒抗体 B.1.3 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的柏平缕瓜花叶病毒抗体 B.1.4 底物 对硝基苯磷酸二钠（ρ NPP） B.1.5 PBST 缓冲液（洗涤缓冲液 pH7.4 ） 氯化钠 (NaCl) 8.0 g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 0.2 g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 1.15 g 氯化钾 (KCl) 0.2 g 叠氮化钠 (NaN3) 0.2 g 吐温 20（Tween-20 ） 0.5 g 加入 900 mL水溶解，用 NaOH或HCl调节 pH值到 7.4，然后加蒸馏水至 1 L。 B.1.6 样品抽提缓冲液（pH7.4） 亚硫酸钠（ Na2SO3） 1.3 g 聚乙烯吡咯烷酮（ PVP，MW24,000 ～40,000） 20.0 g 叠氮化钠（ NaN3） 0.2 g PBST 定容至 1 L，4℃储存。 B.1.7 包被缓冲液（pH9.6） 碳酸钠（ Na2CO3） 1.59 g 碳酸氢钠（ NaHCO3） 2.93 g 叠氮化钠（ NaN3） 0.20 g 加入 900 ml 水溶解，用 HCl 调节 pH 值到 9.6，然后加蒸馏水至 1 L，保存在 4 ℃中。 B.1.8 酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4） 牛血清白蛋白（ BSA）或 脱脂奶粉 2.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（ PVP，MW24,000 ～40,000） 20.0 g 叠氮化钠（ NaN3） 0.2 g PBST 定容至 1 L，4℃储存。 B.1.9 底物（ρNPP）缓冲液 (pH9.8) 氯化镁（ MgCl2） 0.1 g 叠氮化钠（ NaN3 ） 0.2 g 二乙醇胺 97 mL 溶于 800 mL 蒸馏水中，用 HCl 调 pH 值至 9.8，蒸馏水定容至 1 L，4℃储存。 B.2 程序 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100 μL/ 孔，37℃孵育 2 h，清空孔中溶