以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5204 —2020 植物病原细菌筛查 MALDI -TOF MS 法 Plant pathogenic bacteria screen MALDI -TOF MS method 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5204—2020I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：冯建军、陈枝楠、刘杰、王飞、龙海、章桂明。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5204—2020植物病原细菌筛查 MALDI -TOF MS 法 1 范围 本文件规定了植物病原细菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测方法。 本文件适用于植物病原细菌纯培养物快速筛查检测。 2　规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4　方法原理 细菌细胞体内大约含有 200 个 ~6 000 个蛋白质分子，占菌体干重 50 % 左右，具有种属特征， 可通过 MALDI-TOF MS 测定小分子多肽分子量及结构等信息，实现细菌的种属鉴定。 5　仪器及用具5.1 仪器 高压灭菌锅、光照培养箱、天平（感量 1/100 ；1/10000） 、水浴锅、纯水仪、旋涡振荡器、台式 离心机、冰箱、超净工作台、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪、超声波震荡仪。 5.2 用具 培养皿、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、微量移液器（0.5 μL、2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、 1 000 μL） 、PCR 反应管（0.2 mL、0.5 mL、1 mL） 、Tip 头（0.1 μL~10 μL、5 μL~200 μL、100 μL~1000 μL ）、 质谱分析样品靶。 6　试剂、溶液和培养基 所有试剂、溶液和培养基配方见附录 A。 7　筛查方法7.1 菌株培养 供试菌株划线接种到 NBY 等相关培养基活化培养，28 ℃ ±2 ℃黑暗培养 48 h 后备用。以正式出版文本为准2 SN/T 5204—20207.2 菌体处理 具体步骤见附录 B。 7.3 质谱分析 7.3.1 仪器条件 7.3.1.1 仪器：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。 7.3.1.2 激光能量：根据样品，可在 0 %~100 % 范围调节。 7.3.1.3 质谱扫描范围：1000 Da~20000 Da。 7.3.1.4 检测方式：线性正离子检测方式。 7.3.1.5 微生物指纹图谱库：仪器自带数据库或自建同等类型数据库。 7.3.2 质控标准品校准 每次检测样品前推荐使用标准品 Peptide Calibration Standard 和 Protein Calibration Standard I 的混合 液或者同等类型标准品的特征峰校准质谱仪。 7.3.3 点样 7.3.3.1 在质谱靶上点 1 μL 上清液，每个样品点 4 个重复。 7.3.3.2 取 1 μL 标准校正溶液作为对照。 7.3.3.3 室温自然晾干后，尽快点上 1 μL 基质，晾干。 7.3.4 鉴定 将样品靶标板放入仪器内，设定激光能量、质谱扫描范围等参数，进行质谱数据采集。然后将经 过处理的质谱数据自动 / 手动导入本地微生物图谱库，将获得的质谱分析图谱与微生物指纹图谱库进 行比对，通过仪器自带软件计算 log（score）值，判断未知菌的种类。 8　结果判定8.1 若 log（score）值大于等于 2.2 小于等于 3.0，则可判定植物病原细菌的种。 8.2 若 log（score）值大于等于 2.0 小于 2.2，则可判定植物病原细菌的属。 8.3 若 log（score）值小于 2.0，则无法判定植物病原细菌的属。 8.4 需进一步判定，可根据细菌相关标准方法鉴定；无相应标准的按照常规细菌鉴定方法鉴定。 9　样品与原始数据保存9.1　样品保存 存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存 6 个月，以备复验，如涉及到贸易纠纷 则应保存到纠纷解决完毕。 9.2　原始数据保存 样品检测结束后，其原始记录单、谱图和检验报告或证书应归档，妥善保管以备复验、谈判和仲裁。 9.3　菌株保存 分离到的菌株进行超低温保存或冻干保存，以备复验、谈判和仲裁。以正式出版文本为准3 SN/T 5204—2020附 录 A （规范性附录） 试剂、溶液与培养基 A.1　试剂 无水乙醇、异丙醇、乙腈、三氟乙酸（TFA）和甲醇，以上有机溶剂均为色谱级；无菌去离子 水、α-氰基 -4-羟基肉桂酸（Alpha -Cyano -4-hydroxycinnamic acid，HCCA） 、标准品 Peptide Calibration Standard 和 Protein Calibration Standard I。 A.2　溶液A.2.1　基质溶液：称量 5 mg HCCA 溶解于 500 μL 乙腈：10 % 三氟乙酸：无菌去离子水（2 ： 1 ： 1）溶 剂中，形成饱和溶液约 10 mg/mL 的基质溶液备用。每次使用前新鲜配制。 A.2.2　标准校正溶液：分别选取 1 管 Peptide Calibration Standard 和 Protein Calibration Standard I，加入 125 μL 0.1% TFA 的 50% 乙腈溶剂，充分混匀后，-20 ℃保存备用。 或者使用同等类型标准品溶液。 A.3　培养基 A.3.1　营养肉汁酵母液培养基（NBY） ：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 2 g，三水磷酸氢二钾 2.6 g，磷酸二氢钾 0.5 g，葡萄糖 2.5 g，蒸馏水 1000 mL，121 ℃高温灭菌 15 min 后加入 1 mol/L 硫酸镁溶液 1 mL ；对于 NBY 固体培养基，需要加入 15 g 琼脂粉。A.3.2　营养肉胨培养基（NB） ：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 5 g，蒸馏水 1000 mL，pH=7.0~ 7.2，121 ℃ 灭菌 15 min，若是需要固体培养基（NA） ，请加入 15 g 琼脂粉。以正式出版文本为准4 SN/T 5204—2020附 录 B （规范性附录） 菌体处理 B.1　水洗 用消毒灭菌过的接种针或枪头挑菌落并称取 1 mg~2 mg 装有 1000 μL 灭菌去离子水的 1.5 mL 离心 管中，振荡混匀，10 000 r/min 离心 2 min，弃上清。 B.2　溶剂处理 加入 300 μL 灭菌去离子水振荡充分混匀，加入 900 μL 无水乙醇振荡充分混匀，10 000 r/min 离心 2 min，弃上清留沉淀菌体备用（必要时，再离心一次，尽量去除乙醇和水） 。 B.3　蛋白析出 加入 200 μL 0.1%TFA 处理后，离心，弃上清液，加入 25 μL 70% 甲酸，仔细混匀，再加入 25 μL 乙腈，仔细混匀，在有冰袋控温的条件下超声处理 10 min，10 000 r/min 离心 2 min，取上清液进行质 谱分析。