以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5203 —2020 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 65. 150 CCS C 50 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施鱼类物种鉴定　基因条形码的检测 技术规范 Identification of fish species — Technical specification based on DNA barcoding以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5203—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳海关、深圳华大海洋研究 院、深圳市农产品质量安全检验检测中心。 本文件主要起草人：郑晓聪、王敏、温智清、阚式绂、刘荭、石琼、何俊强、黄玉、于力、王 津津、刘莹、贾鹏、史秀杰、兰文升、秦智锋。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5203—2020鱼类物种鉴定　基因条形码的检测技术规范 1　范围 本标文件定了鱼类基因条形码鉴定中的样品处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定 等操作程序和规范。 本文件适用于对自然环境种化产生的野生型鱼类或其残存的组织进行物种鉴定 , 不适合杂交选育 的品种。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　　　基因条形码　DNA barcoding 可用于物种鉴定的具有生物物种序列特征的 DNA 片段，本标准中专指鱼类线粒体基因组中 COI 基因 658 bp 的标准片段。3.2　　　基因条形码鉴定技术　DNA barcoding identification technique 一种利用基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对 的基础之上，它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。3.3　　　序列相似度　similarity of the sequences 反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。 3.4　　FASTA 格式　FASTA format 生物信息学术语，又称 Pearson 格式，是一种用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核 苷酸或者氨基酸碱基用单个字母表示，序列的第一行一般用“＞”起始，随后可以添加序列名或者注释，第二行为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或者氨基酸编码符号，如核苷酸使用 ATCG 表示，序列中不能出现回车等字符。 示例： ＞１ GTGTGTGGGTATGATTCTAAACTGACAAATCGCGCCTATTTATACTTTTTCCCCGGGGTTTAAATTCCTTGGCCCCCAT GTGGTTT C TTTAATTTTAGATTGTGGAACCCATTTTCTTAATCCGTAATCG以正式出版文本为准2 SN/T 5203—20204　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BOLD ：生物条形码数据系统（barcoding of life datasystem） 。 5　试剂和材料 5.1　水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2　醋酸铵，分析纯。5.3　乙醇，分析纯。5.4　异丙醇，分析纯。5.5　蛋白酶 K，分析纯。5.6　 高保真 DNA 聚合酶、dNTPs （含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP） 、MgSO 4、PCR 缓冲液（不含 Mg2+） 和溴酚蓝等试剂，可选用专业试剂公司提供的商品化试剂。 5.7　 引物：用去离子水将每条引物配制成 100 μmol/L 储存液，置 -20 ℃以下冻存；使用时取适量配制 成 10 μmol/L 工作液，避免多次冻融。序列见表 1。 表 1　引物和序列 引物 名称 5’-3’ 备注 上游引物FishF2t1 TGTAAAACGACGGCCAGT CGACTAATCATAAAGATATCGGCAC其中下划线部分为通用 测序引物 M13F（ -20）VF2t1 TGTAAAACGACGGCCAGT CAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 下游引物FishR2t1 CAGGAAACAGCTATGACA CTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA其中下划线部分为通用 测序引物 M13R（ -27）FR1dt1 CAGGAAACAGCTATGAC ACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA 扩增线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅰ（ COⅠ）基因约 700 bp 片段。 5.8　标准分子量：推荐使用 100 bp DNA marker。5.9　琼脂糖，分析纯。 6　器材与设备 台式离心机、各量程可调移液器、可调式恒温浴、微量核酸蛋白测定仪、超净工作台、PCR 扩 增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。7　取样 样品包括活鱼、鱼卵、鲜冻的肉块、单一鱼类制作的肉糜等。宜取鲜活的组织，成鱼优先选取肌 肉组织（心、脑、脾、肾、肝、肠、胃等器官也适用） ，鱼卵取卵膜。如需非致死性取样，剪取部分 鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块 3 mm 3～5 mm3的肌肉块即可。 采集的组织置于冰上低温保存备用，如需长期保存，应置于≤ -20 ℃冷冻或置于 75% 乙醇中固定 保存。以正式出版文本为准3 SN/T 5203—20208　实验步骤 8.1　设立对照 设置空白对照、阴性对照和阳性对照。用已知含鱼类成分的样品作阳性对照，用已知不含鱼类成 分的样品作阴性对照，用等体积的去离子水代替模板 DNA 作空白对照。 8.2　DNA 提取 取 20 mg 样品组织剪碎置于洁净 1.5 mL 离心管中，加入 600 μL 裂解液（见附录 A 中 A.1）和 20 μL 蛋白酶 K 溶液（见附录 A 中 A.2） ，混匀，于 56 ℃水浴 1 h ～3 h，期间不时轻微振动混匀；待组 织消化完全，冷却至室温，加入 200 μL 醋酸铵溶液（见附录 A 中 A.3） ，混匀，冰上放置或 4 ℃冷却 5 min～10 min，使蛋白质盐析出来；于 4 ℃，12 000 g离心 10 min，将上清液转移至另一洁净的 1.5 mL 离心管中，于 4 ℃，12 000 g 离心 10 min，取上清液至另一个洁净 1.5 mL 离心管中，加等体积 异丙醇，轻轻摇匀，4 ℃放置 15 min ；4 ℃，12 000 g离心 10 min 沉淀 DNA ；弃上清，加 1 mL 75% 乙醇，轻轻混匀，于 4 ℃，12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，晾干；干燥后加入 50 μL 去离子水溶解； DNA 提取液应置于冰上备用，若需长期保存应置于≤ -20 ℃保存。 也可采用经验证可靠的 DNA 提取纯化试剂盒进行核酸提取，参照说明书使用。 8.3　DNA 浓度和纯度的测定 吸取 DNA 提取液 2 μL，以去离子水作为空白对照，使用 NanoDrop 微量核酸蛋白测定仪测定 DNA 模板的质量浓度及 A260/A280。DNA 的质量浓度根据式（1）计算： DNA 的质量浓度 = A260×50× 稀释倍数（ng/ μL） ……………………………（1） 提取的 DNA 浓度要求大于等于 5 ng/ μL，A260/A280 的比值在 1.7 ～ 1.9 之间。 8.4　PCR 扩增 在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 2 配制反应体系， 加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳 性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。 表 2　PCR 反应体系 组分 加样量 /μL 含量 / 浓度 10×PCR 缓冲液（不含 Mg2+） 5 1× MgCl2（25 mmol/L） 5 2.5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each） 1 0.2 mmol/L FishF2t1（10 μmol/L） 0.5 0.1 μmol/L VF2t1（10 μmol/L） 0.5 0.1 μmol/L FishR2t1（10 μmol/L） 0.5 0.1 μmol/L FR1dt1（10 μmol/L） 0.5 0.1 μmol/L 高保真 DNA 聚合酶（5 U/ μL） 0.5 0.05 U/μl 模板 / 对照 1 50 ng ～500 ng 去离子水 35.5 加至 50 μL 将已加样的 PCR 反应管短暂离心后放入 PCR 仪，扩增反应条件设定： 94 ℃预变性 2 min ；94 ℃ 变性 30 s, 50 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 45 s, 30 个循环；72 ℃ 7 min ；4 ℃保存。以正式出版文本为准4 SN/T 5203—20208.5　琼脂糖电泳 用新鲜配制的 1×TAE 电泳缓冲液 （见附录 A 中 A.4） 配制含 1 μg/mL 溴化乙锭 （见附录 A 中 A.5） 的 2% 琼脂糖凝胶。取适量扩增产物和溴酚蓝指示剂按比例混匀后进行电泳检测，设 DNA Marker 同 步电泳；采用 5 V/cm ～8 V/cm，电泳 1 h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记录结果。 8.6