以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 65.020.30 B 43 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施梅花鹿物种鉴定技术规范　 实时荧光 PCR 法 Protocol for species identification of Cervus Nippon — Real-time PCR methodSN/T 5202 —2020 代替 SN/T 3011.1— 2011以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5202—2020前 言 本文件根据 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国长春海关。本文件主要起草人：刘韬、刘婧、五准、王玮琳、刘金华、曲辉、彭博、高明。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5202—2020梅花鹿物种鉴定技术规范—实时荧光 PCR 法 1　范围 本文件规定了梅花鹿物种鉴定实时荧光 PCR 方法。 本文件适用于梅花鹿源性产品（梅花鹿茸、梅花鹿血、梅花鹿胎盘、梅花鹿托等非深加工产品） 的定性检测。 ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。Ct 值 clycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4　缩略语 下列缩略语适用于文件。PCR ：链式聚合反应（polymerase chain reaction） 。 DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） 。 dNTP ：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 。CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium ammonium bromide） 。Tris ：三羟甲基氨基甲烷（ tris-( hydroxymethyl)-aminometha） 。 EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid） 。 Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus） 。 UNG ：尿嘧啶 -N- 糖基化酶（uracil-N-glycosylase） 。 OD ：光密度值（optical density） 。 ddH2O ：双蒸水（double distilled water） 。 5　试剂与材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB 6682 的要求。 5.1　检测用引物和探针 5’端引物 F:5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ；以正式出版文本为准2 SN/T 5202—20203’端引物 R:5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ； 探针 P:5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA-3 ；梅花鹿基因扩展靶标参考序列参见附录Ａ。 5.2　试剂 5.2.1　CTAB 提取缓冲液：20 ng/L CTAB，0.1mol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl, 0.02 mol/L EDTA， pH 8.0 5.2.2　CTAB 沉淀液：5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl5.2.3　蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）5.2.4　三氯甲烷5.2.5　异丙醇5.2.6　70% 乙醇5.2.7　TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HC(pH 8.0)，1 mmol/LEDTA(pH 8.0)。 5.2.8　 荧光定量 PCR 预混液：10 μL 反应体系包括：1 U ～2 U 的 Taq 酶、1×PCR 缓冲液、2.5 mmol/ L～4.0 mmol/L 的 Mg 2＋、0.2 U～ 1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A，C，G)TPs、0.2 mmol/L～ 0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX 染料 ( 某些荧光 PCR 仪不需要 ROX 校正 )。如果具有等效的商品化试剂盒，则 可使用这些等效产品。 6　仪器设备6.1　实时荧光 PCR 仪 6.2　离心机（离心力 12 000 g）6.3　离心管（1.5 mL，2.0 mL）6.4　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6.5　微量移液器（2.5 μ L，20 μ L，200 μ L，1 000 μ L） 6.6　研钵或粉碎装置。6.7　恒温水浴锅（10 ℃ ～90 ℃） 6.8　天平（感量 0.01 g） 7　检验步骤7.1　样品的 DNA 提取 称取研磨后的样品 200 mg 或 200 μL 液体样品于 2.0 mL 离心管中，加入 1.5 mL CTAB 提取缓冲液 和 10 μL 蛋白酶 K 溶液 ，65℃ 30 min, 期间不时振荡混匀；13 000 g 离心 10 min，转移上清于洁净的 离心管中，加 750 μL 三氯甲烷 / 异戊醇（24 ：1，V/V） ，混匀，13 000 g 离心 5 min，转移上清液于 洁净的离心管中；加 2 倍体积 CTAB 沉淀液，室温静止 60 min，13 000 g 离心 15 min，弃上清。加入 350 μL NaCl 溶液将沉淀重悬浮。再加入 350 μL 三氯甲烷，旋涡振荡进行混匀，13 000 g 离心 10 min。以正式出版文本为准3 SN/T 5202—2020转移上清后加入 0.6 倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置 20 min，13 000 g 离心 10 min，弃上清。 加入 500 μL 70% 乙醇洗涤一次，晾干；加入 100 μL TE，溶解沉淀。立即使用或－ 20℃保存备用。 也可以用等效的 DNA 提取方法提取 DNA 模版。 7.2　实时荧光 PCR 检测7.2.1　扩增反应体系： 体积为 20 μL ：2× 荧光定量 PCR 预混液 10 μL、引物对 (10 nmol/L) 各 1.0 μL、模板 DNA （100 ± 50 ng DNA）2.5 μL、荧光探针（10 nmol/L）0.5 μL、ddH 2O 5.0 μL。 7.2.2　反应条件： 50 ℃，2 min ；95 ℃，10 min ；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40 个循环。反应循环参数可根据基 因扩增仪型号的不同进行适当调整。7.2.2　反应体系中对照的设置 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含梅花鹿或梅花鹿源性成分的样品作 阳性对照，用已知不含梅花鹿源性成分的样品作阴性对照，用等体积的 ddH 2O 代替模板 DNA 作空白 对照。 8　结果判断与表述 实时荧光 PCR 定性检验 8.1　 如 Ct 值≤ 35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中检出梅花鹿源 性成分。 8.2　 如 Ct 值≥ 40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中未检出梅花鹿 源性成分。8.3　 如 35<Ct 值 <40 应重做实时荧光 PCR 扩增。再次扩增的 Ct 值 <40，且阴性对照、阳性对照和空白 对照结果正常，则可判定该样品中检出梅花鹿源性成分。再次扩增的 Ct 值 >40，且阴性对照、照和空白对照结果正常，则可判定该样品中未检出梅花鹿源性成分。以正式出版文本为准4 SN/T 5202—2020附　录　A ( 资料性 ) 梅花鹿基因扩展靶标参考序列 ATGCTGACGAGGACTGATTTGACTCAATGTGCTATGTACGATAAGCAACATTATGTACTATGTACTG TAAATAATAGAAAATACATGCTTATAAGCATGGGGCATATAATATAATGTACTATTATACATAGTATGTC CTAATACATTAATTTATGTACTATTATGCATAATATGTCCTATACACCGATTTTATGTA CCATTGTACATGT GTGCCTTAATGCA TTAATTTTATGTACTACAAACACATAAGGTTATATCACGTGCTTTGTTGTGTAATTAG TAGGACATAAAATGTAAATTGGATGTTGAGTAGAAAGCTGTATTAAAATATTAAAATTTTTTGGAAATTT AATACTGATAAAGTTCTTGATTTTTATGGAACTATATTAATAAGCGT F