以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5201 —2020 代替 SN/T 1162— 2002 林麝物种鉴定技术规范 Protocol for species identification of moschus berezovskii 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 65.020.01 CCS B 43 2019 -12-30发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5201—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、东北林业大学。本文件主要起草人：吕继洲、吴绍强、林祥梅、袁向芬、王晓龙、王彩霞。 以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5201—2020林麝物种鉴定技术规范 1　范围 本文件规定了林麝物种的形态学和 PCR 鉴定方法。 本文件适用于林麝及其产品的物种鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB 19489　实验室　生物安全通用要求GB/T 27403　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3　术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。COI ：细胞色素 c 氧化酶亚基 I（cytochrome c oxidase subunit 1） ； DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） ； dNTP ：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） ；PCR ：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） ；SDS ：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate） 。 4　形态特征 林麝典型形态特征见附录 A。 5　PCR 检测 5.1　仪器设备 5.1.1　常规 PCR 仪。 5.1.2　组织研磨器。5.1.3　超净工作台。5.1.4　制冰机。5.1.5　高速冷冻离心机。5.1.6　水浴锅。5.1.7　台式小型离心机。5.1.8　常规冰箱。以正式出版文本为准2 SN/T 5201—20205.1.9　旋涡振荡器。 5.1.10　电泳仪。5.1.11　凝胶成像系统。5.1.12　微量可调移液器（10 μL、100 μL、1 000 μL）及配套吸头。 5.2　试剂与材料 5.2.1　无水乙醇。 5.2.2　蛋白酶 K（20 mmol/ μL ）。 5.2.3　50×TAE 缓冲液（试剂配制见附录 B 中 B.1） 。5.2.4　阳性对照（林麝的基因组 DNA） 。5.2.5　Tirs-HCl 缓冲液（试剂配制见附录 B 中 B.3） 。5.2.6　生理盐水（试剂配制见附录 B 中 B.4） 。5.2.7　EDTA 溶液（试剂配制见附录 B 中 B.5） 。5.2.8　TES 缓冲液（试剂配制见附录 B 中 B.6） 。5.2.9　10% SDS 溶液（试剂配制见附录 B 中 B.7） 。5.2.10　氯化钠。5.2.11　三氯甲烷。5.2.12　异丙醇。5.2.13　冰乙酸。5.2.14　Tris 饱和酚。5.2.15　70% 乙醇。5.2.16　Goldview 核酸染料。 5.2.17　 Taq DNA 聚合酶。 5.2.18　dNTP（2.5 mmol/L） 。 5.2.19　琼脂糖。5.2.20　灭菌双蒸水（应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，见附录 B 中 B.8） 。 5.3　引物对 MBF: 5’ - CTTTCTTATTACTTCTAGCCTCC-3’ （扩增林麝 COI 5’端基因通用上游引物） MBR: 5’ - ATACTGATCATACAAATAATGGA-3’ （扩增林麝 COI 5’端基因通用下游引物）用双蒸水将引物稀释为 20 μmol/L 工作浓度，-20℃保存备用。 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，试验用水应符合 GB/T 6682 的规定。 5.4　检测方法 5.4.1　样品的处理 5.4.1.1　直接取新鲜的、冷藏的或冷冻的样品 200 μL 用于核酸提取。 5.4.1.2　 使用生理盐水洗去血污，取 100 mg ～200 mg 样品置于液氮中充分研磨，将所研磨的粉末放入 1.5 mL 的离心管中用于核酸提取。5.4.2　样品 DNA 的提取 采用以下方法提取 DNA，也可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按操作说明书进行操作。 a）取 5.4.1 中处理好的样品，加入 450 μL TES 缓冲液混匀后再加入 50 μL SDS 溶液 （10%） ，5 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL） ，充分混匀后，于 56 ℃保温 4 h，每 2 h 摇 1 次。以正式出版文本为准3 SN/T 5201—2020b）加入等体积的 Tris 饱和酚（500 μL） ，混匀。 c）取上层水相于新管，加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25∶24∶1） （试剂配制见附录 B 中 B.9）混匀，12 000 r/min 室温离心 5 min。 d）取上层水相于新管，加入等体积的三氯甲烷混匀，12 000 r/min 室温离心 5 min。 e）取上层水相，加入 2.5 倍体积的无水乙醇，混匀，置于 -20 ℃ 2 h 以上或过夜，12 000 r/min 室温离心 15 min。 f）弃上清液，加入 1 mL 预冷的 70% 乙醇，12 000 r/min 室温离心 5 min。 g）吸弃残留液体，室温干燥 10 min 左右，用 50 μL 灭菌双蒸水溶解，-20 ℃保存备用。 5.4.3　PCR 扩增检测 5.4.3.1　PCR 反应体系 10×PCR 缓冲液 5.0 μL dNTPs （2.5 mmol/L） 5.0 μL MBF（20 pmol/ μL） 1.0 μL MBR（20 pmol/ μL） 1.0 μL 样品 DNA 2.0 μL Taq DNA 聚合酶 0.5 μL 灭菌双蒸水 35.5 μL 总体积为 50 μL 体系，用漩涡混匀器进行混匀，瞬间离心，4℃备用。 注： 也可使用其他商品化 PCR 扩增试剂盒，如 Promega GoTaq ® G2 DNA Polymerase 试剂盒。 样品检测时，同时要设阳性对照和空白对照。阳性对照是已知的林麝提取的基因组 DNA（见附 录 B.2） ，空白对照是灭菌双蒸水。5.4.3.2　PCR 程序及反应条件 反应参数为 95 ℃ 1 min ；95 ℃变性 30 s，48 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，38 个循环；然后 72 ℃延伸 10 min，最后 4℃保存。 注：没有热盖 PCR 仪器需加入矿物油 40 μL。 5.4.4　PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制 1% 琼脂糖凝胶板（Goldview 染料终浓度 0.5 μg/mL） 。将平板放入水平电 泳槽中，加入 1×TAE 电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将 PCR 扩增产物 5 μL 和相应的上样缓冲液混 合，分别加入样品孔中，电压 80 V～100 V，电流 40 mA～50 mA，电泳 30 min～45 min。5.4.5　凝胶成像系统观察 扩增产物经电泳结束后，用凝胶成像仪观察检测结果、拍照，记录试验结果。 5.5　结果判定5.5.1　形态初筛 根据附录 A 所述林麝及其近似种形态特征，初步筛查出林麝疑似样品，以待进一步核酸扩增、 测序检测鉴定。5.5.2　PCR 实验成立的判定依据 在经过琼脂糖凝胶电泳后，只有阳性对照引物扩增条带大小与预期一致（243 bp） ，同时阴性对以正式出版文本为准4 SN/T 5201—2020照无相应片段时，才可判定 PCR 扩增试验成立，否则本次实验无效。 5.5.3　疑似样本的判定依据 若样品有条带扩增且大小与预期一致，可判定样品中疑似含有林麝源性成分，后将扩增获得的 COI 序列进行测序；若样品无目的条带，则判定样品林麝源性成分阴性。 5.5.4　林麝物种的判定 将测序获得序列与附录 C 中参考 COI 序列（也可使用国际 DNA 条形码鉴定数据库 Boldsystems 中的数据，www.boldsystems.org）进行 BLAST 多重序列比对，具体判定如下：如果与所获序列相似性 最高的序列属于林麝，且相似性达到 99% 以上时，则判定为对应实验的阳性结果，进而确定为检出林麝源性成分。