以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5199 —2020 代替 SN/T 1162— 2002 家畜家禽成分 DNA 条形码检测技术规范 Inspection protocol for livestock -derived and poultry -derived ingredients with DNA barcode method 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 07.080 CCS B 43 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5199—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆 海关、中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国厦门海关。 本文件主要起草人：罗宝正、薄清如、邵建宏、王勤、赵福振、吴绍强、廖秀云、吕继洲、徐 海聂、聂福平、陈轩、沙才华、郑传发、杨俊 、苗丽、唐泰山、孔繁德。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5199—2020家畜家禽成分　DNA 条形码检测技术规范 1　范围 本文件规定了家畜、家禽成分 DNA 条形码检测方法。 本文件适用于家畜、家禽单一物种样品的检测，不适用于多物种混合样品中动物成分的检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27401　实验室质量控制规范　动物检疫GB/T 27403　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3　术语、定义和缩略语 3.1　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1　 　　家畜　livestock 人工饲养驯化且可以人为控制其繁殖的哺乳纲动物，如猪、牛、绵羊、山羊、马、驴、骡、骆 驼、兔、猫、狗等。3.1.2 　　家禽　poultry 人工饲养的为了获取其肉、卵和羽毛等的鸟纲动物，一般为雉科和鸭科动物，如鸡、鸭、鹅等， 也有其他科的鸟类如火鸡、鸽子、鹌鹑等。 3.2　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromide） 。Cytb ：细胞色素 b （cytochrome b） 。DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid） 。EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid） 。Na 2EDTA ：乙二胺四乙酸二钠（ethylene diaminetetraacetic acid disodium salt） 。 Tris ：三羟甲基氨基甲烷（tris (hydroxymethyl) aminomethane） 。 PCR ：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） 。TBE ：缓冲液（tris -borate -EDTA buffer） 。以正式出版文本为准2 SN/T 5199—20204　原理 DNA 条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增 且相对较短的 DNA 片段。在遇到一种未知物种或者物种的一部分时，通过描绘其组织的 DNA 条形 码，与国际数据库内的其他条形码进行比对，如果与其中一个相匹配，便可确认物种。本标准使用的PCR 引物可以同时扩增家畜、家禽甚至更多脊椎动物的一段线粒体（mitochondrion）DNA，通过序列分析和比对，进行物种鉴定。 5　试剂和材料5.1　DNA 提取试剂 5.1.1　裂解液，配制方法见附录 A。 5.1.2　苯酚。5.1.3　三氯甲烷与异戊醇混合液（按 24 : 1 的比例混合） 。 5.1.4　3 mol/L 乙酸钠。5.1.5　无水乙醇。5.1.6　70% 乙醇。5.1.7　TE 缓冲液（Tris -EDTA buffer） ，配制方法见附录 A。 5.2　PCR 扩增试剂 5.2.1　Master Mix（2×） 。 5.2.2　10 μmol/L 上游引物（序列 5 ’ -CCC-CGC-CTG-TTT-ACC-AAA -AAC -AT-3’）。 5.2.3　10 μmol/L 下游引物（序列 5 ’-GCT-CCA-TAG-GGT-CTT-CTC-GTC-TT-3’）。 5.2.4　双蒸水，应符合 GB/T 6682 的要求。5.2.5　去离子水，应符合 GB/T 6682 的要求。 5.3　凝胶电泳试剂5.3.1　2% 琼脂糖凝胶。 5.3.2　TBE 溶液（1×） ，配制方法见附录 A。5.3.3　溴化乙锭或焦红。 6　仪器设备6.1　电子天平。 6.2　微量移液器。6.3　恒温水浴锅。6.4　台式冷冻离心机。6.5　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6　PCR 检测系统。6.7　电泳仪。6.8　凝胶成像分析系统。以正式出版文本为准3 SN/T 5199—20207　检验步骤 7.1　概论 7.1.1　 样品总 DNA 提取、DNA 浓度和纯度测定、PCR 扩增、凝胶电泳分析过程按照 GB/T 27401 和 GB/T 27403 的要求进行。 7.1.2　 对于干制样品，应首先进行水洗清理表面或刮掉表面可能污染的动物或人源 DNA。对于新鲜样 品，应从样品内部取样。 7.1.3　 设立质控阴性对照和阳性样品对照，阴性对照、阳性对照和检测样品使用相同方法提取 DNA。 阳性对照使用任意一种家畜、家禽肉样（如牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅等） ，阴性对照使用任意一种非脊椎动物肉样（如虾、螃蟹、海星等） ，阴性样品应无其他动物和人源 DNA 污染。7.1.4　可以使用等效的 DNA 提取试剂进行 DNA 提取。 7.2　样品总 DNA 提取7.2.1　 对于固态样品，如肌肉、内脏、皮毛、牙齿、骨骼、头角等，应充分碾碎、研磨、混匀，取约 100 mg 作为被提取物；对于液态样品，应充分振荡混匀，取约 200 μL 作为被提取物。 7.2.2　 将被提取物转移至 1.5 mL 离心管中，加入 700 μL 裂解液（5.1.1） ，置于 65 ℃中水浴 3 h，期间 不时振荡混匀。 7.2.3　 经 13 523 g离心 5 min 后，取上清液并转移至新的 1.5 mL 离心管。加入等体积苯酚（5.1.2） ，充 分混匀后，13 523 g再离心 5 min。 7.2.4　取上清液，加入等体积三氯甲烷与异戊醇的混合溶液（5.1.3） ，充分混匀，13 523 g离心 5 min。 7.2.5　 取上清液，加入 1/10 体积的乙酸钠溶液（5.1.4） ，混匀后再加入 2 倍体积 -20 ℃预冷的无水乙醇 （5.1.5） ，-20 ℃静置 1 h，13 523 g离心 5 min 后，弃去上清液。 7.2.6　用 70％乙醇 （5.1.6） 洗涤一次，在超净台内室温下晾干，加入 50 μL TE 缓冲液 （5.1.7） 溶解沉淀， 制成 DNA 溶液。 7.3　DNA 浓度和纯度的测定 取 5 μL DNA 溶液，用双蒸水 （5.2.4） 稀释至 1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A 260和A280。当 A260/A280的比值介于 1.7 ～1.9，浓度介于 10-3 μg/μL～10-1 μg/μL 时，适宜 PCR 扩增。DNA 的浓度按式（1）计算： C=A×N×52/1 000 …………………………… （1） 式中： C—— DNA 浓度，单位为微克每微升（ μg/μL ）； A—— 260 nm 处的吸光值； N——核酸稀释倍数。 7.4　PCR 扩增 7.4.1　体系 在冰盒中配制下列反应体系，每个检测反应体系共计 25 μL，其中 DNA 溶液（10 ng～100 ng） 2.0 μL。 向每个 PCR 反应管中加入配制好的反应混合液。 可以使用等效的 PCR 扩增试剂。 反应体系如下： —— Master Mix（2×） 12.5 μL； ——上游引物（10 μmol/L ） 1.0 μL； ——下游引物（10 μmol/L ） 1.0 μL；以正式出版文本为准4 SN/T 5199—2020——双蒸水　　　　 8.5 μL； —— DNA 溶液　　　 2.0 μL。 7.4.2　加样 在各 PCR 反应管中分别加入制备好的样品、阴性对照和阳性对照 DNA 溶液，空白对照使用水作 为模板。盖紧管盖后混匀，瞬时离心 5 s～10 s。 7.4.3　扩增 进行 PCR 扩增，反应结束后保存于 4 ℃环境中。反应参数为： —— 94 ℃预变性 5 min； —— 94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 个循环；—— 72 ℃延伸 5 min。 7.5　凝胶电泳分析 取 PCR 扩增产物 5 μL 置于 2% 琼脂糖凝胶（5.3.1）和 TBE（1×）溶液（5.3.2）中，以 110 V 电 压进行 30 min 电泳，电泳结束后使用凝胶成像分析系统观察并记录结果。不同动物扩增出的目的条带大小在 249 bp 左右略