以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5198 —2019 代替 SN/T 1162—2002 熊蜂短膜虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Crithidia bombi 中华人民共和国海关总署 发 布 2020 -12-30发布 2021 -07-01实施ICS 11.220 CCS B 41以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 开本 880×1230 1/16 印张 0.75 字数 22 千字 2021 年 1 月第一版 2021 年 1 月第一次印刷 印数 1—500 书号：155175·38 定价 16.00 元熊蜂短膜虫检疫技术规范行 业 标 准 SN/T 5198—2020 * * *北京市朝阳区东四环南路甲 1 号 （100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行 网址 www.customskb.com/book以正式出版文本为准I SN/T 5198—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国北京 海关、福建农林大学、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。 本文件主要起草人：张体银、郑腾、李丹丹、张伟、黄少康、王武军、张志灯、于师宇、白泉 阳、陈美传。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5198—2020熊蜂短膜虫检疫技术规范 1　范围 本文件规定了熊蜂短膜虫检疫的聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测技术。 本文件适用于熊蜂短膜虫的检疫。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 3　术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。Ct 循环阈值（cycle threshold） DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（ethidium bromide） ITS 内转录间隔区 (internal transcribed space) PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） TBE 三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid ） TE TE 缓冲液（Tris-EDTA buffer solution） 4　设备、材料和试剂 4.1　设备 4.1.1　高压灭菌锅。 4.1.2　梯度 PCR 扩增仪。4.1.3　荧光 PCR 仪。4.1.4　高速冷冻离心机（转速 12 000 r/min） 。4.1.5　微量移液器。4.1.6　生物安全柜。4.1.7　DNA 相对分子质量标准品（100 bp ～1 000 bp） 。4.1.8　水平电泳仪。4.1.9　凝胶成像系统。4.1.10　电子天平（感量 0.01 g） 。以正式出版文本为准2 SN/T 5198—20204.1.11　冰箱（2 ℃～8 ℃和 –20 ℃） 。 4.2　试剂4.2.1　水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2.2　液氮。4.2.3　无水乙醚。 4.2.4　无水乙醇。 4.2.5　0.01 mol/L 磷酸盐（PBS）缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.1。4.2.6　10% SDS 溶液，配制方法见附录 A 中 A.2。4.2.7　蛋白酶 K。4.2.8　5 mol/L 的 NaCl 溶液，配制方法见附录 A 中 A.3。4.2.9　CTAB/NaCl 溶液，配制方法见附录 A 中 A.4。4.2.10　三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 A 中 A.5。4.2.11　酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 A 中 A.6。4.2.12　异丙醇。4.2.13　TE 缓冲液。4.2.14　10×PCR 缓冲液。4.2.15　dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。4.2.16　 Taq DNA 聚合酶。 4.2.17　琼脂糖。4.2.18　0.5×TBE 缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.7。4.2.19　上样缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.8。 4.2.20　EB（10 mg/mL） ，配制方法见附录 A 中 A.9。 4.2.21　DNA 相对分子质量标准物 Marker。4.2.22　DNA 纯化回收试剂盒。 4.3　PCR引物 上游引物 Cri-F1: 5’- GGAAACCACGGAATCACATAGAC-3’ 下游引物 Cri-R1: 5’- AGAAGAAGAGAGACGAGAAGGAG-3’根据熊蜂短膜虫 ITS 基因核酸序列设计，扩增长度为 447 bp（参见附录 B 中 B.1） ，用水溶解至 10 μmol/L 后，保存于 -20 ℃备用。 4.4　实时荧光PCR引物和探针 上游引物 Cri-F2：5’ -GTTGGGAAAGAGAGTCTA-3’下游引物 Cri-R2：5’ -GACGAGAAGGAGAGTAAG-3’ Taq Man 探针 qPCR-P： FAM-AACACACAAACAAACCAAACACACA- TAMRA 根据熊蜂短膜虫 ITS 基因核酸序列设计，扩增长度为 80 bp（参见附录 B 中 B.2） ，用水溶解至 10 μmol/L 后，保存于 -20 ℃备用。 4.5　质控物质 使用感染熊蜂短膜虫的熊蜂腹部组织或含目的片段的 DNA 作为阳性对照，使用未感染熊蜂短膜 虫的健康熊蜂腹部组织作为阴性对照，用水作为空白对照。以正式出版文本为准3 SN/T 5198—20205　采样 5.1　采样比例 5.1.1　当蜂群数量小于等于 10 群时，所有蜂群均采样。 5.1.2　当数量在 11～100 群时，以 10 群采样量为基础，每增加 10 群，采样量增加 1 群。5.1.3　当蜂群数量为 101～200 群时，按总群数的 15％采样。 5.1.4　当蜂群数量大于等于 201 群时，按总群数的 10％采样。 5.2　采样方法 从待检蜂群中采取活力较弱的熊蜂 10～20 只，放入烧杯内盖好，记录群号。检疫前先将活蜂用 乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻 10 min。 6　PCR检测 6.1　DNA的提取 6.1.1　剪取所采得熊蜂腹部组织样品置于灭菌过的研钵中，加入适量液氮反复研磨成粉末状，也可使 用磷酸盐缓冲液研磨成匀浆，转移至 1.5 mL 离心管中，12 000 r/min 离心 2 min，弃上清液，加入 50 μL TE 缓冲液，使样品充分悬浮后，加入 60 μL 10% SDS 溶液和 10 μL 20 mg/mL 的蛋白酶 K，混匀后于 37 ℃ 下温育 1 h。6.1.2　加入 100 μL 5 mol/L 的 NaCl 溶液，上下颠倒充分混匀，加入 80 μL CTAB/NaCl 溶液，混匀后 65 ℃ 温育 10 min；加入 700 μL 三氯甲烷 / 异戊醇混合液（体积比为 24 : 1） ，混匀后 12 000 r/min 离心 5 min。 6.1.3　吸取上清液至另一干净离心管，加入等体积的酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇混合液（三者体积比为 25 : 24 : 1） ，上下颠倒混匀，12 000 r/min 离心 5 min。 6.1.4　吸取上清液至另一干净离心管，加入 2 倍体积预冷的异丙醇沉淀 DNA，轻轻混匀，4 ℃下 12 000 r/min 离心 15 min，彻底去除上清液。6.1.5　用 600 μL 70% 预冷乙醇洗涤沉淀，4 ℃下 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，再瞬时离心，用移 液器彻底吸除酒精，在超净工作台上自然晾干。6.1.6　加入 20 μL TE 溶液溶解 DNA，-20 ℃下保存。DNA 提取也可选用等效的商品化试剂盒。 6.2　PCR扩增 6.2.1　反应体系 普通 PCR 反应体系见表 1。PCR 扩增可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。 表1　普通PCR反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量 /μL 10×PCR 缓冲液 10× 1× 2.5 dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 Taq DNA 聚合酶 5 U/μL 0.1 U/μL 0.5 上游引物 Cri-F1 10 μmol/L 0.4 μmol/L 1 下游引物 Cri-R1 10 μmol/L 0.4 μmol/L 1以正式出版文本为准4 SN/T 5198—2020名称 储存液浓度 终浓度 加样量 /μL 模板 DNA — — 2 水 — — 17.5 总体积 — — 25 注 ： 反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。 6.2.2　反应程序 94 ℃预变性 5 min；之后 94 ℃变性