以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5197 —2019 牛结节疹病毒荧光定量 PCR 操作规程 Quarantine protocol for real time PCR of lumpy skin disease virus 2019 -12-27 发布 2020 -07-01 实施ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5197—2019I前 言 本标准按照 GB/T 1.1— 2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆海关。本标准主要起草人：聂福平、李应国、王昱、杨俊、王国民、李贤良、张雷、史梅梅、吴蕊。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5197—2019牛结节疹病毒荧光定量 PCR 操作规程 1 范围 本标准规定了牛结节疹病毒的荧光定量 PCR 检测方法。 本标准适用于牛结节疹病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于 本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Bp ：碱基对（base pair）CPE ：细胞病变效应法（cytopathic effect）Ct ：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cycle threshold）DNA ：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid）LSDV ：牛结节疹病毒（lumpy skin disease virus）PBS ：磷酸盐缓冲盐水 （phosphate buffered saline）PCR ：聚合酶链反应 （polymerase chain reaction） Taq 酶：DNA 聚合酶 （TaqDNA polymerase） 4　原理 采用 Taq Man 荧光定量 PCR 方法，通过比对牛结节疹病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒的保守 基因，针对 ITR 区域设计一对仅在牛结节疹病毒基因保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标 记 MGB 探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中 5 ’端标记 FAM 荧光素为报告荧光 基团（R） ，3 ’端标记的 MGB 荧光素（Q）在近距离内能吸收 5 ’端荧光基团发出的荧光信号，称 为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，探针上 R 基团发出的荧光信号被 Q 基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时， Taq酶发挥 5 ’→3’ 的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的 R 基团游离出来，所发出的荧光不再为 Q 所吸收而被检测仪所接收。随着 PCR 反应的循环进行，PCR 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。以正式出版文本为准2 SN/T 5197—20195 设备和试剂 5.1 主要仪器和设备 5.1.1 荧光定量 PCR 仪。 5.1.2 低温高速离心机、微量高速离心机。 5.1.3 低温冰箱。 5.1.4 微型振荡器。 5.1.5 生物安全柜。 5.1.6 恒温水浴锅。 5.1.7 高压灭菌锅。 5.1.8 微量可调移液器。 5.2 试剂、耗材 5.2.1 营养液：配制方法见 A.1。 5.2.2 维持液：配制方法见 A.2。 5.2.3 细胞分散液：配制方法见 A.3。 5.2.4 商品化微量病毒核酸提取试剂盒或其他商品化试剂盒。 5.2.5 Premix Ex Taq（Probe qPCR）荧光 PCR 缓冲液。 5.2.6 引物：根据牛结节疹病毒（LSDV）国际标准株基因序列，在其最保守的 ITR 区序列设计合成 一对特异性引物，F: 5 ’-TTGTCAGAAACGAGG-3 ’，R: 5 ’-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3 ’和一条 MGB 探针 [（FAM）5 ’-TCTTGCTAAAATACCA-3 ’（MGB）] 配制成 10 μmol/L，-20 ℃保存。 注：以上所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水的规格。 5.3 标准毒株和细胞 5.3.1 标准毒株：以 LSDV 国际标准毒株 Neethling 株为试验的参照毒株。 5.3.2 细胞：按照常规方法取健康羔羊睾丸，制备原代睾丸细胞；或采用 MDBK 细胞、Vero 细胞。 6 对照样品制备 6.1 阳性对照样品 由牛结节性皮肤病参考实验室提供或按照下列方法制备：将牛结节疹国际标准毒株（5.3.1） 按 10% 接种原代睾丸细胞（5.3.2） ，于 37 ℃吸附 1 h 后加入维持液（5.2.2） ，37 ℃ 5% CO2培养， 待 CPE 达到 70% 时收获病毒悬液：冻融 3~4 次，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。也可 以用含 LSDV ITR 扩增区 DNA 序列的质粒作为阳性对照。 6.2 阴性对照样品 由牛结节性皮肤病参考实验室提供或按照下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞冻融 3~4 次，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。 7 操作方法 7.1 样品的处理 7.1.1 所有的实验操作应符合 GB 19489、GB/T 27401 和 GB/T 27403 的相关要求，在生物安全二 级及以上实验室进行实验。以正式出版文本为准3 SN/T 5197—20197.1.2 组织样品：包括皮肤、肺、脾脏、淋巴结、肌肉等。取 2 g~5 g 组织样品切成小块，加入 5 mL~10 mL 预冷的 PBS 缓冲液匀浆 2 min，制成悬液，反复冻融 3 次，4 ℃ 5 000 r/min 离心 10 min， 取 200 μL 上清液进行核酸提取。 7.1.3 血液样品：不需进行特殊处理，直接取 200 μL 进行核酸提取。 7.2 病毒 DNA 的提取和纯化 取阴阳性对照样品及按照 7.1.2 和 7.1.3 处理的样本各 200 μL，在生物安全柜中，按照商品化 微量病毒核酸提取试剂盒操作说明要求提取病毒 DNA。 7.3 荧光定量 PCR 检测 7.3.1 荧光 PCR 反应体系 检测牛结节疹病毒荧光定量 PCR 反应体系见表 1。以牛结节疹病毒 DNA 作为阳性对照，以 不含 LSDV 的牛肉组织、原代睾丸细胞 DNA 作为阴性对照，以水作为空白对照。 表 1 荧光定量 PCR 反应体系 名称 贮备液浓度 体系工作液浓度 加样数量 / μL Premix Ex Taq 缓冲液 2× 0.8× 8 正向引物 10 μmol / L 0.5 μmol / L 1 反向引物 10 μmol / L 0.5 μmol / L 1 MGB 探针 10 μmol / L 0.2 μmol / L 0.4 模板 DNA — — 2 灭菌去离子水 — — 7.6 反应体系总体积 — — 20 注：荧光定量 PCR 反应体积可根据实际情况进行相应比例的调整。 7.3.2 荧光 PCR 反应参数 PCR 检测的循环参数：95 ℃预变性 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共 40 个循环，60 ℃ 34 s 收 集 FAM 荧光信号。 8 结果判定 8.1 结果分析 8.1.1 读取检测结果，阈值设定原则以阈值线超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。 8.1.2 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 8.2 质控标准 阴性对照的检测结果应没有特异性扩增，阳性对照的 Ct 值应小于 28.0。以正式出版文本为准4 SN/T 5197—20198.3 结果判定 8.3.1 阳性 Ct 值小于等于 35，而且出现明显的扩增曲线，判定样品中存在牛结节疹病毒核酸。 8.3.2 阴性 无特异性扩增曲线或 Ct 值大于 40，判定样品中无牛结节疹病毒核酸。 8.4 临界值有效判定原则 35.0 ＜ Ct 值≤ 40.0 的样本应重做，重做结果无 Ct 值且无明显扩增曲线则为阴性，而有 Ct 值且有明显扩增曲线则为阳性。