以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5196 —2020 代替 SN/T 1162— 2002 猪轮状病毒感染检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with porcine rotavirus 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11.220 CCS B 41 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5196—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中国人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国南宁 海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国海口海关、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。 本文件主要起草人：张体银、姜焱、聂丹、郑腾、花群义、李丹丹、王武军、白泉阳、张志灯、 于师宇、陈美传。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5196—2020猪轮状病毒感染检疫技术规范 1　范围 本文件规定了猪轮状病毒感染酶联免疫吸附试验、反转录 - 聚合酶链反应和实时荧光反转录 - 聚合酶链反应检测技术。 本文件适用于猪轮状病毒感染的抗体检测和病原核酸鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088　出入境动物检疫采样GB 19489　实验室　生物安全通用要求 3　术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件：cDNA 互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid） Ct 循环阈值（cycle threshold） ddH2O 双蒸水（couble-distillation H2O） DEPC 焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（ethidium bromide） ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay） HRP 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase） OD 值 光密度值（optic density value） PBS 磷酸盐缓冲液 （phosphate-buffered saline buffer） PRV 猪轮状病毒（porcine rotavirus） RNA 核糖核酸（ribonucleic acid） RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction） TBE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid ） 4　仪器和设备4.1　Ⅱ级生物安全柜。 4.2　高压灭菌器。4.3　96 孔酶标板。以正式出版文本为准2 SN/T 5196—20204.4　恒温培养箱。 4.5　洗板机。4.6　酶标仪。4.7　冷冻离心机。4.8　单道可调微量移液器（2 μL～20 μL，20 μL～200 μL，100 μL～1 000 μL ）。 4.9　多道可调微量移液器（10 μL～100 μL ）。 4.10　PCR 仪。 4.11　水平电泳仪。 4.12　凝胶成像仪。4.13　荧光 PCR 仪。4.14　冰箱（2 ℃～ 8 ℃和 –20 ℃） 。 5　试剂和材料 5.1　水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2　猪轮状病毒 VP6 蛋白。5.3　标准阳性血清：猪轮状病毒疫苗免疫仔猪制备，经病毒中和试验检测为阳性。5.4　标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪轮状病毒疫苗的仔猪血清，经病毒中和试验检测为阴性。5.5　灭菌生理盐水：配制见附录 A 中 A.1。5.6　包被液：配制见附录 A 中 A.2。5.7　磷酸盐缓冲液（PBS） ：配制参见附录 A 中 A.3。5.8　洗涤液：配制见附录 A 中 A.4。5.9　封闭液：配制见附录 A 中 A.5。5.10　样品稀释液：配制见附录 A 中 A.6。5.11　抗猪 PRV 酶标抗体。5.12　底物显色液：配制见附录 A 中 A.7。5.13　终止液：配制见附录 A 中 A.8。5.14　焦碳酸二乙酯处理水（DEPC 水） ：配制见附录 A 中 A.9。5.15　Trizol。5.16　三氯甲烷。5.17　异丙醇。5.18　无水乙醇。5.19　反转录试剂盒。5.20　 Taq DNA 聚合酶。 5.21　dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。5.22　10×PCR 缓冲液。5.23　琼脂糖。5.24　分子量标准（100 bp ～ 600 bp） 。 5.25　TBE 电泳缓冲液，配制见附录 A 中 A.10。5.26　上样缓冲液，配制见附录 A 中 A.11。5.27　EB（10 mg/mL） ，配制见附录 A 中 A.12。5.28　DNA 纯化回收试剂盒。5.29　 质控物质：阳性对照为含 PRV 的阳性组织或含有 PRV 的病毒培养液；阴性对照为不含 PRV 的 组织。以正式出版文本为准3 SN/T 5196—20205.30　RT-PCR 用引物 F1、R1 序列： 上游引物 F1 ：5’ - AAAGATGCTAGGGACAAAATTG-3’ ； 下游引物 R1 ：5’ - TTCAGATTGTGGAGCTACTCCA-3’ 。扩增 PRV 各毒株保守序列中大小为 309 bp 片段 （参见附录 B） ，引物用 ddH 2O 溶解至 10 μmol/L 后， 保存于 -20 ℃备用。5.31　实时荧光 RT-PCR 用引物 F2、R2 和探针序列： 上游引物 F2 ：5’ - AGCATGTTGATTAAGTGAGGACT-3’下游引物 R2 ：5’ - ACAGTTACTCTACGTAGCGAGT-3’ ；探针序列为 FAM-AGGCTAACTACCTGGTATCCGA-TAMRA。引物和探针分别用 ddH 2O 溶解至 10 μmol/L 后，保存于 -20 ℃备用。 6　采样和制样 6.1　 根据 GB/T 18088 确定采样动物数量；涉及病原检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废 弃物处理应按照 GB 19489 要求进行。 6.2　血清样品：通过前腔静脉采血法无菌采血，待其自然凝固后，4 000 r/min 离心 10 min。 6.3　 粪便或肛拭子样品：采集粪便样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 ℃ 5 000 r/min 离心 15 min，收集上清液待检。采集肛拭子样品，用少量灭菌生理盐水浸润后，取上清液待检。 6.4　 组织样品：采集肠、胃等组织样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 ℃ 5 000 r/min 离心 15 min，收集上清液待检。 7　ELISA 检测方法7.1　操作步骤 7.1.1　 包被抗原：将纯化的 VP6 蛋白用包被液稀释至 3 μg /mL，每孔 100 μL，包被酶标板，封口后， 2 ℃～ 8 ℃包被 12 h。ELISA 检测方法可以采用等效的商品化 ELISA 抗体检测试剂盒，根据试剂盒说明 书进行操作。 7.1.2　 弃去孔内液体，每个反应孔加入约 300 μL 的洗涤液进行洗涤，洗涤 5 次，最后一次在洁净的吸 水纸上将酶标板拍干。7.1.3　封闭：每孔加入封闭液 250 μL，置 37 ℃培养箱中封闭 2 h。 7.1.4　重复步骤 8.1.2，置于 4℃保存备用。7.1.5　将待检血清用样品稀释液作 1 :100 稀释，每孔加入 100 μL，同时加入阴性对照和阳性对照血清各 2 孔，每孔 100 μL。置于 37 ℃ 培养箱中反应 1 h。 7.1.6　重复步骤 8.1.2。7.1.7　将抗猪 PRV 酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加入 100 μL，置于 37 ℃ 培养箱中反应 1 h。 7.1.8　重复步骤 8.1.2。7.1.9　显色：每孔加入 100 μL 底物显色液，轻柔摇匀，37 ℃避光显色 10 min。 7.1.10　终止反应：每孔加入 100 μL 终止液终止反应。 7.1.11　读数：在酶标仪上读取 450 nm 吸光值。 7.2　结果判定7.2.1　 在酶标测定仪上检测各孔光吸收值（OD 450） ，计算阳性对照平均 OD450值和阴性对照平 均 OD450值。阳性对照血清平均 OD450值大于 0.6，阴性对照血清平均 OD450值小于 0.16，试验以正式出版文本为准4 SN/T 5196—2020成立。 7.2.2　当样品孔平均 OD450值 （P） 与阴性对照平均 OD450值 （N） 之比大于或等于 2.0 （即 P/N ≥ 2.0） 时， 判定为 PRV 抗体阳性。7.2.3　 当样品孔平均 OD 450值（P）与阴性对照平均 OD450值（N）之比小于 2.0（即 P/N＜ 2.0）时，判 定为 P