以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5194 —2020 代替 SN/T 1162— 2002 羊传染性脓疱皮炎检疫技术规范 Quarantine protocol for contagious pustular dermertitis of sheep and goat 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11.220 CCS B 41 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5194—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国长春海关、中华人民共和国宜兴海关、中华人民共和国惠州 海关、吉林省畜牧兽医科学研究院。 本文件主要起草人：孟庆峰、周宇、童明龙、王伟利、程荣华、姚贵哲、孟日增、王伟琳、宋 战昀。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5194—2020羊传染性脓包皮炎检疫技术规范 1　范围 本文件规定了羊传染性脓疱皮炎临床诊断、病毒分离、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式 反应检测技术。 本文件适用于羊传染性脓疱皮炎的检疫检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规程和试验方法GB 19489　实验室　生物安全通用要求 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4　生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行检测，所有培 养物和废弃物应按照 GB 19489 中的有关规定执行。 5　试剂和材料5.1　所用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 5.2　犊牛睾丸原代细胞的制备（见附录 A 中 A.1） 。5.3　0.01 mol/L（pH7.2）PBS（见附录 A 中 A.2） 。5.4　10 % 十二烷基硫酸钠（见附录 A 中 A.3） 。5.5　20 mg/mL 蛋白酶 K（见附录 A 中 A.4） 。 5.6　引物与探针 根据羊传染性脓疱皮炎特异基因合成一套特异性引物。扩增产物大小为 488 bp。 　　　　　　　　　　引物 1：5’ - CGGCGTATTCTTCTCGGACT -3’　　　　　　　　　　引物 2：5’ - CGGACAGGTCCTTGACGATG -3’根据羊传染性脓疱皮炎特异基因合成一套特异性引物与配套探针。　　　　　　　　　　引物 1：5’ - TGAACCGCTACAACACCT -3’　　　　　　　　　　引物 2：5’ - GAGTCCGAGAAGAATACGC -3　　　　　　　　　　探针：FAM-AACTTCCACCTCAACCACTCCG-TAMRA以正式出版文本为准2 SN/T 5194—20205.7　阳性对照：可溯源的标准毒株，或含目的片段的 DNA 亦可。 5.8　 分 子 生 物 学 试 剂：10×PCR 缓 冲 液、dNTP（2.5 mmol/L） 、 Taq DNA 聚 合 酶（5U/ μL） 、Ex Taq Hs （5U/μL ）。 5.9　0.2 mL 和 1.5 mL 塑料离心管。5.10　吸头，配套移液器使用。5.11　灭菌三角烧瓶：250 mL，500 mL。 6　仪器和设备 6.1　PCR 仪。 6.2　荧光 PCR 仪。 6.3　电泳仪。6.4　凝胶成像系统。6.5　生化培养箱：-5 ℃ ±1 ℃～ 50 ℃ ±1 ℃。 6.6　生物安全柜。6.7　电子天平：感量 0.1 g。6.8　均质器。6.9　生物显微镜。6.10　移液器：量程 0.5 μL～10 μL，量程 10 μL～100 μL，量程 100 μL～1 000 μL。 6.11　高速冷冻台式离心机（最高可达 13 000 r/min） 。 7　临床诊断 7.1　临床症状 临床症状主要分唇型、蹄型及外阴型，见附录 B 中 B.1。 7.2　剖检变化 主要病变见附录 B 中 B.2。 7.3　流行病学 主要流行病学见附录 B 中 B.3。 7.4　初步诊断 根据临床症状、剖检变化、流行病学做出初步诊断。 8　病毒分离8.1　样品处理 采集疑似患病羊痂皮脓疱等病料，加 0.01 mol/L（pH7.2）PBS 研磨制成 1∶10（质量∶体积）的 悬液，5 000 r/min 离心 30 min，取上清液，按 20% 比例加入浓度为 10 000 IU/mL 的双抗 （青、链霉素） ， 4 ℃感作过夜后，保存备用。以正式出版文本为准3 SN/T 5194—20208.2　样品接种培养 犊牛睾丸原代细胞长满 25 cm2细胞培养瓶单层后，弃上清营养液，接种病料处理上清液 l mL， 37 ℃吸附 2 h，弃上清液后加入含 2% 血清的 MEM 细胞维持液，37 ℃静止培养，同时设正常细胞对 照及感染细胞对照。每天观察细胞生长情况和细胞病变（CPE） 。若细胞在接种病料后 4d ～5d 内未出 现病变则连续盲传 3 代后收取培养物；若有 CPE 出现，直接收取培养物。 8.3　结果鉴定 8.3.1　对照细胞正常，接种样品的细胞盲传 3 代后无 CPE，判为阴性。 8.3.2　 细胞初期出现小病灶，病灶中的细胞圆缩，有折光性。进一步培养，CPE 增多，所有细胞脱壁。 经过连续传代后可在 24 h～ 48 h 后产生完全的 CPE。 8.3.3　出现上述典型 CPE 的培养物，用 PCR 和荧光 PCR 进行进一步鉴定。 9　PCR 检测方法9.1　模板 DNA 的制备 取待检样品 8.1 上清液 465 μL，加入 25 μL 10 % 十二烷基硫酸钠和 10 μL 的 20 mg/ mL 蛋白酶 K， 50 ℃水浴摇床上放置 2 h；加入等量的饱和酚溶液 500 μL，振荡混匀 20 s，12 000 r/min 离心 5 min，取 上清液；加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇 （25∶24∶1） ，振荡混匀 20 s，12 000 r/min 离心 5 min， 取上清液；再加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇（24∶1） ，振荡混匀 20 s，12 000 r/min 离心 5 min，取 上清液；最后加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，室温干燥后，加入 50 μL 双蒸馏水溶解沉淀，既得 DNA 模板，-20 ℃贮存备用。另外，DNA 提取也可采 用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按照说明书进行操作。 9.2　反应体系 反应体系为2 5 μL ： 10×PCR 缓 冲 液（Mg 2+ Plus）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL 、引物 （25 μmol/L）各 1 μL、Taq DNA 聚合酶（5U/ μL）5 μL、模板 DNA 1 μL、ddH2O 补足 25 μL。 9.3　反应条件 94 ℃预变性 3 min ；94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，进行 40 个循环；72 ℃延 伸 10 min，4 ℃保存。 9.4　结果观察 用 1×TAE 电泳缓冲液配制 1% 的琼脂糖凝胶，加入最终浓度为 1 μg/mL 的溴化乙锭。用 100 bp DNA ladder Marker 作为对照，对 PCR 产物进行电泳。在凝胶成像系统上观察有无目的大小的特异性 条带。必要时可以对扩增的条带进行测序分析。 9.5　结果判定 在空白对照和阴性对照均无特异条带扩增，阳性对照出现 488 bp 目的条带（参见附录 C）的条 件下：待检样品出现目的条带判定为核酸阳性结果；待检样品未出现目的条带判定为阴性。以正式出版文本为准4 SN/T 5194—202010　实时荧光 PCR 检测方法 10.1　模板 DNA 的制备 同 9.1。 9.2　反应体系 反应体系为2 5 μL ： 10×PCR 缓 冲 液（Mg2+ Plus）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL 、引物 （25 μmol/L）各 1 μL、 ；Ex Taq Hs（5 U/ μL）5 μL、模板 DNA 1 μL、探针 1 μL、ddH2O 补足 25 μL。 10.3　反应条件 95 ℃预变性 10 min ；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s，在此收集荧光进行 40 个 循环。 10.4　结果判定 10.4.1　质控标准 阴性对照和空白对照无 Ct 值并且无扩增曲线；阳性对照的 Ct 值应小于等于 32，并出现典型的扩 增曲线；如阴性对照、空白对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。10.4.2　结果描述及判定10.4.2.1　阴性 无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无羊传染性脓疱皮炎病毒核酸。 10.4.2.2　阳性 Ct 值小于等于 32，并出现典型的扩增曲线，表明样品中有羊传染性脓疱皮炎病毒核酸。