以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5191 —2020 禽肾炎检疫技术规范 Quarantine protocol for avian nephritis 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11.220 CCS B 41 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5191—2020前 言 本文件按照 GB/T1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国天津海关、锦州医科大学、中华人民共和国青海岛海关。本文件主要起草人：王乃福、赵微、刘洋、胡炜、陈小金、黄晨、陈本龙、董志珍、赵祥平。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5191—2020禽肾炎检疫技术规范 1　范围 本文件规定了禽肾炎的病毒分离及鉴定、反转录 - 聚合酶链式反应、实时荧光反转录 - 聚合酶 链式反应和间接酶联免疫吸附试验的技术要求。 本文件适用于禽肾炎的检疫。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析试验室用水规格和实验方法GB 19489　 实验室　生物安全通用要求 3　术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。AN ：禽肾炎（avian nephritis） ；ANV ：禽肾炎病毒（avian nephritis virus） 。 4　临床诊断 4.1　禽肾炎简介 禽肾炎简介参见附录 A。 4.2　临床症状 本病可明显抑制 1 月龄以内雏鸡生长发育和增重，其他症状不明显。一般呈一过性隐性感染，本病 经人工接种无特殊病原微生物雏鸡后，血浆中尿酸盐浓度高于正常浓度的 2～ 10 倍，21 d 后恢复正常。 4.3　病理变化 本病的病理变化主要表现于肾脏，其他脏器一般没有变化。随年龄增大，病变程度减轻，4 日龄 内的雏鸡病变最为严重，甚至会出现死亡情况。剖检死亡的雏鸡，见到肾脏、脾脏和腹膜表面及腿部 筋腱周围大量的尿酸盐沉积，2 月龄仅发生较轻肾炎病变。 根据流行病学、临床症状和病理变化可做出禽肾炎的初步诊断，进一步的确诊有赖于实验室诊断。 5　实验室诊断 5.1　生物安全措施以正式出版文本为准2 SN/T 5191—2020试验环境和防护要求见 GB 19489。 5.2　病原分离及鉴定 5.2.1　材料和试剂5.2.1.1　器材 生物安全柜、离心机、二氧化碳培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜等。 5.2.1.2　水 符合 GB/T 6682 中一级水要求。 5.2.1.3　试剂 胰酶消化液、细胞生长液、细胞维持液、双抗液，具体配制见附录 B.1 ～B.4。 5.2.1.4　细胞 鸡肾细胞（CKC） 。 5.2.2　病毒分离培养5.2.2.1　样品采集和制备5.2.2.1.1　 未出现临床症状时，活禽无菌采集病鸡泄殖腔拭子（需带有可见粪便） ，雏禽采集新鲜粪便； 在动物死亡后，无菌采取肾脏和直肠内容物作病料。 5.2.2.1.2　样品置于含抗生素的 pH7.0 等渗磷酸盐缓冲液（PBS）中。5.2.2.1.3　粪便和搅碎的组织，用含抗生素的 PBS 制成 10%～ 20% （质量浓度） 的悬浮液，拭子浸入 3 mL 含抗生素的 PBS 中，充分振荡。在 4 ℃作用 4 h 或过夜，或室温作用 2 h。拭子在反复挤压后弃去。5.2.2.1.4　4 ℃ 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液经 0.22 μm 滤膜过滤除菌。 5.2.2.2　样品运送及保存条件 立即进行实验室检测的样品，保存于 4 ℃ 或置于冷藏盒中快速送达，不能立即检测的样品置 于 -70℃ 冷冻保存。 5.2.2.3　样品接种 将制备好的样品接种于 24 孔细胞培养板培养的单层 CKC 细胞中，每份样本至少接种 4 孔，设正 常细胞对照至少 4 孔，每孔 0.1 mL ～0.2 mL，37 ℃吸附 1 h，倾去多余液体，加入 1 mL 维持液，放入 37 ℃的 5% 二氧化碳恒温培养箱中培养 3 d～5 d。5.2.2.4　结果观察 样品接种 24 h 后，于倒置显微镜下逐日观察细胞状态并做好相应记录，若细胞对照孔正常，而 接种样品孔出现细胞变圆、聚堆成簇或由于细胞脱落形成空斑等细胞病变现象时，冻融 3 次后转入 新长满单层细胞的培养板，如果观察仍出现类似细胞病变，且日渐明显，则可收获细胞培养物，放入 -70 ℃冰箱中待鉴定。如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，再盲传两代。盲传过程中若出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放入 -70 ℃冰箱中；若未出现细胞病变，则为禽肾炎病毒分离结果阴性。 5.2.2.5　培养物鉴定以正式出版文本为准3 SN/T 5191—2020由于禽类肠道病毒均可引起相同的 CPE，所以收获的培养物应进行鉴定。可使用反转录 - 聚合 酶链式反应（RT-PCR） 、实时荧光 RT-PCR 和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法来鉴定是否为禽肾 炎病毒感染。 5.3　反转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）5.3.1　仪器和设备5.3.1.1　PCR 扩增仪。 5.3.1.2　电泳仪。 5.3.1.3　紫外凝胶成像仪。5.3.1.4　高速台式冷冻离心机。5.3.1.5　生物安全柜。5.3.1.6　可调移液器：1 μL～10 μL, 20 μL～100 μL, 100 μL～1 000 μL。 5.3.2　试剂和材料 5.3.2.1　0.01 mol/L PBS 缓冲液：pH7.2。 5.3.2.2　裂解液 Trizol ：4 ℃保存。5.3.2.3　三氯甲烷。5.3.2.4　异丙醇。5.3.2.5　DEPC 水。5.3.2.6　氯化镁：25 mmol/L。5.3.2.7　dNTPS ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。5.3.2.8　5× 逆转录酶缓冲液和 10× Taq 酶缓冲液。 5.3.2.9　引物（Primer）:10 μmol/L。根据 ORF1 b 基因序列设计，扩增产物长度为 450 bp。 上游引物 PANV-F ： 5-TAGAATCACTCTTCTTCCAACTGGA-3下游引物 PANV-R ： 5-TCAAGGTCTGGCAGCCTGCGC-3 5.3.2.10　 Taq 酶：5 U/ μL。 5.3.2.11　逆转录酶 AMV ：10 U/ μL。 5.3.2.12　75% 乙醇。5.3.2.13　阳性对照：接种 ANV 病毒的细胞培养物。5.3.2.14　阴性对照：正常鸡肾细胞（CKC） 。 5.3.3　样品采集和制备 见 5.2.2.1。 5.3.4　样品运送及保存条件 见 5.2.2.2。 5.3.5　试验步骤5.3.5.1　样品 RNA 提取5.3.5.1.1　 在样品处理区，取 150 μL 粪便上清液样本置处理后 1.5 mL 灭菌离心管，做好标记，同时设 立阳性样品对照、阴性样品对照，加入 3 倍体积 Trizol，振荡混合 20 s，静置 5 min。 5.3.5.1.2　加入 200 μL 三氯甲烷，振荡混合 20 s，静置 5 min ；4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min，取上清液 置另一个标记好的 1.5 mL 灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，-20℃静置 15 min。以正式出版文本为准4 SN/T 5191—20205.3.5.1.3　4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min，轻轻弃去上清液，加入 1 mL DEPC 水配制的 75% 乙醇。 5.3.5.1.4　4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min，轻轻弃去乙醇，倒置滤纸上，干燥 10 min，加入 20 μL DEPC 水溶解 RNA，提取的 RNA 须在 2 h 内反转录，若需保存须放置 -70 ℃冰箱。 5.3.5.2　逆转录合成 cDNA 在 PCR 管中加入 10 μL 反转录模板（样品 RNA） 、1 μL 下游引物 PANV-R、4 ul 5 倍逆转录酶浓 缩缓冲液、2 μL dNTP、0.5 ul RNA 酶抑制剂（20 U/ μL） 、1 μL 逆转录酶 AMV（10 U/ μL）和 1.5 μL 水， 总体积为 20 μL。充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到 PCR 管底。置于 42 ℃反转录 45 min，立即 冰浴，用作 PCR 模板。5.3.5.3　PCR 扩增 DNA5.3.5.3.1　50 μL PCR 反应体系组成 配制每个样品 PCR 反应液，见表 1。 表 1　每个样品 PCR 反应液配制表 试剂 用量 / uL 10× Taq 酶缓冲液 5 dNTPs（10 mmol/L） 1 氯化镁（25 mmol/L） 4 Taq 酶（5 U/ μL） 1 上游引物 PANV-F 1 下游引物 PANV-R 1 cDNA 模板 5 DEPC 水 32 总体积 50 5.3.5.3.2　PCR 循环参数 将以上体系瞬时离心，充分混匀后，置 PCR 仪内。 —— 95 ℃ 3 min，1 个循环；—— 95 ℃ 30 s ，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，30 个循环；—— 68 ℃ 7 min.，1 个循环；—— PCR 产物