以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5189 —2020 鮰类肠败血症检疫技术规范 Quarantine protocol for Enteric septicemia of channel catfish 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.150 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 1589—2020I前 言 本文件是根据 GB / T 1.1— 2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国厦门海关、福州市疾病预防控制 中心。 本文件主要起草人：郑腾、张志灯、张体银、唐寰宇、王武军、李宋钰、白泉阳、郭书林、 李文最。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 1589—2020鮰类肠败血症检疫技术规范 1 范围 本文件规定了鮰类肠败血症的临床诊断、细菌分离、生化鉴定及聚合酶链式反应鉴定技术。 该文件适用于鮰类肠败血症的临床诊断和实验室检疫。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC / T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC / T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC / T 7214 鱼类爱德华氏菌检测方法 3 术语、定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4　临床诊断 4.1　群体检查 发病鱼池往往水质较差，病鱼沿池边离群独游，反应迟钝，摄食量下降或不摄食。患病初期，病 鱼胸鳍侧常有直径为 3 mm ~5 mm 的损伤，外部如针状的创伤，并深入到肌肉。有的病鱼头朝上、尾朝 下呈垂直状游动，部分病鱼有时呈痉挛式的螺旋状游动，继而死亡。 4.2　个体检查 因鮰鱼规格和个体免疫力等差异，鮰类肠败血症的临床症状不尽相同，主要表现出急性型和慢性 型两种形式。 急性型又称为肠道败血型，最为常见，死亡率高，主要表现为败血症和肠炎。病鱼体表出现褪色 斑，腹部肿胀，有的头部和躯体皮肤溃疡，一侧或两侧眼球突出，肌肉有点状出血或出血斑。鳃丝苍 白并有出血点，鳃盖、腹部、颌部和鳍条基部皮肤出现瘀斑和出血，有的则出现白色斑点，肛门红肿，后期病鱼出现全身性水肿。 慢性型又称为头盖穿孔型，病菌最初感染部位是鼻根的嗅觉囊，再经嗅觉器官移行到脑，形成肉 芽肿性炎症。后期头背颅侧部溃烂形成一个深孔，直到裸露出整个脑组织，形成似“马鞍”状的病灶；随着病情的发展，病灶中心形成溃疡，表现为“头盖穿孔型”病症。以正式出版文本为准2 SN/T 1589—20204.3　解剖检查 剖开病鱼腹腔，内有大量含血或清亮的液体，流出的腹水不易凝固。肝水肿、质脆，有出血点和 灰白色的坏死灶；脾和肾肿大、出血；胃膨大；肠道扩张，肠粘膜水肿、充血、发炎，肠腔内充满气 体或淡黄色的水样液体；有时还伴随有套肠出现。脑组织形成肉芽肿，肌肉具弥散性肉芽肿性炎症。 4.4　临床检查判定 群体检查和个体检查中出现以上病症，结合剖检结果，可以初步判断为疑似鮰类肠败血症，需要 进一步进行实验室诊断。 5　实验室诊断5.1　设备 5.1.1　光学显微镜。 5.1.2　培养箱（28 ℃±1 ℃和 37 ℃±1 ℃）。 5.1.3　水浴锅。5.1.4　高速离心机。5.1.5　微量可调移液器。5.1.6　PCR 仪。5.1.7　电泳仪。5.1.8　紫外凝胶成像系统。5.1.9　酒精灯。 5.2　材料和试剂5.2.1　水，应符合 GB / T 6682 所规定一级水的要求。 5.2.2　血液琼脂平板，配制方法见附录 A.1。5.2.3　吕氏碱性美蓝染液，配制方法见附录 A.2。5.2.4　结晶紫染色液，配制方法见附录 A.3。5.2.5　革兰氏碘液，配制方法见附录 A.4。5.2.6　沙黄复染液，配制方法见附录 A.5。5.2.7　半固体琼脂管，配制方法见附录 A.6。5.2.8　四甲基对苯二胺 1% 水溶液，配制方法见附录 A.7。5.2.9　Hugh-Leifson 培养基，配制方法见附录 A.8。5.2.10 　磷酸盐缓冲液（PBS） ，配制方法见附录 A.9。 5.2.11 　TE 缓冲液（pH 8.0）配制方法见附录 A.10。 5.2.12 　十二烷基硫酸钠（SDS） 。 5.2.13 　蛋白酶 K。 5.2.14 　氯化钠（NaCl） 。 5.2.15 　十六烷基三乙基溴化铵（CTAB） 。 5.2.16 　氯仿。 5.2.17 　异戊醇。 5.2.18 　水饱和酚。 5.2.19 　70% 乙醇。 5.2.20 　Taq DNA 聚合酶。以正式出版文本为准3 SN/T 1589—20205.2.21 　脱氧核苷酸三磷酸 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。 5.2.22 　引物（Primer） ：10 μmoL / L。根据鮰鱼爱德华氏菌酶表达蛋白基因（Eip）序列设计，扩增长 度为 276 bp。 上游引物 ESC-CM3 ：5 ’-TCA TCA CAT CAT CTA GCG ATT-3 ’ 下游引物 ESC-CM4 ：5 ’-CTT TAC ACA GAT AGG CGA TAC-3 ’ 5.2.23 　琼脂糖（电泳纯） 。 5.2.24 　TAE 电泳缓冲液，配制方法见附录 A.11。 5.2.25 　上样缓冲液，配制方法见附录 A.12。 5.2.26 　DNA 相对分子质量标准物 Marker，推荐使用 100 bp DNA ladder。 5.2.27 　DNA 纯化回收试剂盒。 5.2.28 　鮰爱德华氏菌，菌种保藏编号为 ATCC 33202。 5.3　样品的采集 样品的采集和运输按 SC / T 7103 的规定执行。 5.4　细菌的分离和鉴定 5.4.1　样品的处理 无临床症状鱼可以无菌采集其肠、肾、肝和脑等内脏器官作为样品，也可直接采集病灶组织作为 样品，样品采用无菌生理盐水冲洗并捣碎后进行分离培养。对于体表有临床症状的鱼，可以采用无菌 棉拭子或经灭菌后的接种环插入病灶深处的组织取样。 5.4.2　细菌的分离 将样品按常规方法划线接种于血液琼脂平板（配制方法见附录 A.1） ，28 ℃±1 ℃下培养 24 h~ 48 h。挑 取圆形、灰白色、边缘整齐、湿润、呈半透明状的单个优势菌落在血液琼脂平板上再次划线分离纯化。5.4.3　染色及形态学观察5.4.3.1　病料涂片的美兰染色 取病鱼的肾、肝和脑等组织进行涂片，在酒精灯火焰上固定，冷却后用吕氏碱性美蓝染液（配制 方法见附录 A.2）染色 1 min~ 3 min，水洗，待干后镜检。 5.4.3.2　培养物涂片的革兰氏染色 培养物涂片后在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液 （配制方法见附录 A.3） ，染色 1 min 后水洗。 再滴加革兰氏碘液（配制方法见附录 A.4） ，作用 1 min 后水洗。滴加 95% 乙醇脱色约 30 s ；或将 95% 乙醇滴满整个涂片后立即倾去，再用 95% 乙醇滴满整个涂片，脱色 10 s。水洗，滴加沙黄复染液（配制方法见附录 A.5）复染 1 min。水洗，待干后镜检。 5.4.3.3　菌体形态 鮰爱德华氏菌革兰氏染色阴性，呈杆状，多为单个存在，无芽胞，无鞭毛。 5.4.4　生理生化试验5.4.4.1　运动性试验 将分离菌穿刺接种于半固体琼脂（配制方法见附录 A.6）两管，分别置 28 ℃±1 ℃和 37 ℃±1 ℃以正式出版文本为准4 SN/T 1589—2020下培养 24 h。如分离菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；如分离菌只生长在穿 刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。 5.4.4.2　氧化酶试验 吸取四甲基对苯二胺 1% 水溶液（配制方法见附录 A.7）滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色或深 紫色的为阳性，不变色的为阴性。 5.4.4.3　葡萄糖氧化与发酵（O / F ）试验 挑取分离菌穿刺并划线于 Hugh-Leifson 培养基（配制方法见附录 A.8）上，于 28 ℃±1 ℃下培养 18 h~ 24 h，如果开口管和封口管内的培养基都产酸（变黄）则分离菌为发酵型（F） ，如果开口管变黄 色而封口管不变色则为氧化型（O） 。 5.4.4.4　其他生化试验 镜检观察符合 5.4.3.3 的分离菌，当满足以下条件时：运动性检查表现为 28 ℃下为阳性且 37 ℃下 为阴性；氧化酶试验为阴性；O / F 试验为发酵型，分离菌可以鉴定为肠杆菌科。肠杆菌科的分离菌可 以按 SC / T 7014 和 SC / T 7214 的规定开展鮰爱德华氏菌的生化特性检测（参见附录 B） 。 5.4.4.5　判定 分离菌既符合肠杆菌科特性，又符合附录 B 结果，则分离菌鉴定为鮰爱德华氏菌。如果是部分指 标符合应进一步采用 PCR 进行鉴定。5.4.5　聚合酶链式反应（PCR ） 5.4.5.1　DNA 提取 可以取鱼的脑髓、肝脏、脾脏或肾脏，按 1 ： 10（W / V）加入 PBS 缓冲液（配制方法见附录 A.9） ， 匀浆后作为样品，12 000 r / min 离心 1 min，倒去上清液；也可以从普通营养琼脂平板上挑取经纯培养 的可疑单菌落作为样品，悬浮在 1 mL 的 PBS 缓冲液中，12